山楂原花青素及维生素C对胰岛素抵抗大鼠肝脏炎症反应的影响

李西栋 纪雨含 韩富磊 梁亚楠 宓伟

(1临沂市人民医院心血管内科，山东 临沂 276000；2滨州医学院公共卫生与管理学院)

低度肝脏炎症反应与引发的胰岛素抵抗(IR)和2型糖尿病等代谢性疾病密切相关〔1〕。有研究表明，肝脏炎症反应是引发IR的重要机制〔2〕。促炎症因子如白细胞介素(IL)-1α、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6等炎症因子在脂肪组织中的浓度升高，其在血浆中的浓度也明显高于正常水平，它们通过激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)、κB抑制蛋白激酶(IKK)-β、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2、蛋白激酶(PK)C、核糖体蛋白S6激酶(S6K)1等炎症信号，诱导机体产生IR〔3～5〕。长期高脂饮食会导致胰岛素介导的相关作用减弱，如脂解抑制作用，这时血浆中游离脂肪酸(FFA)浓度会明显升高，促使肝脏生成内源性葡萄糖，胰岛素不能有效抑制肝糖原的合成，从而导致肝脏发生IR，引起血糖升高〔6，7〕，肝脏组织是机体炎症反应和IR的主要器官，因此研究肝脏炎症反应对IR的发生机制具有重要意义。山楂原花青素(HPC)是由不同数量的儿茶素和表儿茶素缩合而成的多酚类低聚化合物，广泛存在于山楂果中。HPC具有清除自由基、降血压、降血脂、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学活性，近年来广泛用于食品和药物的开发〔8〕。维生素C(VC)又称抗坏血酸，广泛存在于新鲜蔬菜水果中，是血浆中最有效的抗氧化剂，其与各种氧自由基迅速反应，有效清除氧自由基，从而达到抗氧化的作用〔9〕。本研究探讨HPC和VC联合用药对IR模型大鼠肝脏炎症反应的影响及分子机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 Wistar大鼠90只，雄性，由滨州医学院实验动物中心提供，体质量(190±16)g，6～8周龄，SPF级，合格证号SCXK(鲁)2015-0006。适应性常规饲料喂养1 w后用于实验。

1.2药物与试剂 主要药物及试剂为：罗格列酮(成都恒瑞制药有限公司，批号H20060578)；HPC(质量分数为95%，中国西安绿天生物技术有限公司，批号20150402)；VC(华南药业集团有限公司，批号H44020774)；兔抗鼠磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)抗体和兔抗鼠p-PI3K、p-AKT、核转录因子(NF)-κB(美国Cell Signaling Technology公司)；兔抗鼠β-actin多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G抗体(美国Millipore公司)；TNF-α、IL-8、IL-4、IL-10、FFA酶联名史疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒，NE-PERTM试剂盒(美国Millipore公司)；Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix：(Thermo Fisher Scientific)，其他试剂均为国产分析纯。

1.3仪器 TGL-16M高速冷冻离心机(上海赫田科学仪器有限公司)；SpectraMax i3x 多功能酶标仪(Molecular Devices)；DYY-6D 电泳仪、DYCZ-24A双垂直电泳槽(北京六一仪器厂)；RE-5298A旋转蒸发器(上海亚荣仪器厂)；Prism 7500反转录(RT)聚合酶链反应(PCR)仪(美国Applied Biosystems公司)；212 PRO凝胶成像分析系统(美国Kodak公司)；HFJ-25高速匀浆机(德国Ika公司)。

1.4实验动物分组 将90只大鼠随机分为对照组(10只)和高脂饮食组(80只)。对照组给予普通饲料(玉米73.5%、麦麸20%、鱼粉5%、谷粉1%、食盐0.5%)，高脂软食组给予高脂饲料(普通饲料78.8%、胆固醇1%、牛胆盐0.2%、蛋黄粉10%、猪油 10%)，同时喂养6个月，通过尾静脉测定空腹血糖≥7.0 mmol/L者为造模成功，共造模成功58只〔10〕设为IR组。造模前后称体重，检测两组造模前后的体重变化。造模后，禁食1夜，次日上午断尾取血1 ml，检测大鼠空腹血糖，同时眼眶静脉取血，离心取上清，分别检测血清胰岛素水平和丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)活性。选取造模成功的50只IR大鼠随机分为模型组(0.9%生理盐水)、HPC(56 mg/kg)组、VC(180 mg/kg)组、HPC(56 mg/kg)+VC(180 mg/kg)组和罗格列酮(2 mg/kg)组各10只。等体积灌胃给药(20 ml)，每天给药1次，持续20 w。

1.5指标检测 最后1次喂养大鼠不禁水但禁食10 h，于眼球取血，4 000 r/min离心8 min，取上清经生理盐水1∶5稀释后，-20℃低温保存，并采取大鼠的肝脏组织。参照ELISA试剂盒方法测定血清中的促炎症因子TNF-α、IL-8和抗炎症因子IL-8、IL-10的水平；参照ELISA试剂盒的方法测定血清和肝脏中FFA的含量。

1.6苏木素-伊红(HE)染色制备肝组织病理切片 取大鼠新鲜肝脏组织，用10%的甲醛溶液固定24 h后石蜡包埋；将修整好的石蜡块置于石蜡切片机上连续切片，片厚约3 μm，置烤箱65℃干燥，贴附30 min；肝组织石蜡切片脱蜡至水：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，95%、85%、75%酒精各5 min，流水冲洗；苏木素染色3～5 min，流水冲洗至切片颜色发蓝，1%盐酸酒精分化3 s立即取出，流水冲洗，0.5%伊红复染10 s，流水冲洗；梯度酒精脱水后中性树胶封片，晾干，光学显微镜观察。

1.7Western印迹检测肝组织PI3K、AKT磷酸化程度和C-NF-κB、N-NF-κB蛋白表达量 取大鼠新鲜肝脏组织100 mg，用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液清洗两次，弃掉PBS液，在肝脏组织中加入2 ml的裂解液裂解细胞，冰浴中低速匀浆提取肝组织中的总蛋白，7 500 r/min离心5 min取上清备用。生理盐水洗涤肝组织，匀浆，研磨，冰上膨胀裂解15 min，之后震荡10 s，12 000 r/min，转移上清即胞质蛋白。加入生理盐水到沉淀中，重悬浮细胞核，冰上裂解20 min，不时搅动，之后12 000 r/min离心10 min，取上清，即为核蛋白，低温冷冻保存〔11〕。取60 μg总蛋白(包括提取的细胞质和细胞核)加入4×蛋白上样液，使用DYY-6D 电泳仪进行电泳分离，电泳分离后将蛋白条带立即移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h，按顺序依次加入一抗(兔抗鼠PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB多克隆抗体，β-actin小鼠多克隆抗体)及相应二抗，洗涤后，用电化学发光(ECL)系统对相应的蛋白条带进行检测，对底片进行曝光、显影、定影。洗片后，用Quanlity One软件扫描各蛋白条带，测定其蛋白灰度值。以β-actin为内参对基因的相对表达量进行定量分析，以对应的总蛋白对磷酸化蛋白的相对表达量进行半定量分析，实验重复5次。

1.8RT-PCR检测肝组织炎症因子mRNA的表达 取小鼠肝脏100 mg，加入600 ml Trizol，低速匀浆破碎细胞，提取总RNA。将RNA 溶于0.3 ml焦碳酸二乙酯(DEPC)水，取适量稀释，测定吸光度值A260和A280，并计算溶解后RNA的纯度和含量。取1 μg总RNA在M-MLV逆转录酶的催化作用下逆转录成cDNA。cDNA于25 ml的反应体系中扩增，各反应物用量参照Maxima SYBR Green qRT-PCR Master mix说明书要求，反应体系包括：cDNA模版6 μl，Maxima SYBR Green qRT-PCR Master mix 12.5 μl，上、下游引物各0.3 μl，超纯水5 μl。反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共45个循环。目的基因mRNA表达量均以β-actin mRNA的量作为内参校正，将正常对照组定为1个单位，实验重复5次。炎症因子各引物序列为：TNF-α：正向引物：5′-ATCCGCGACGTGGAACTG-3′，反向：3′-ACCGCCTGGAGTTCTGGAA-5′；IL-8正向引物：5′-CAAGGCTGGTCCATGCTCC-3′，反向：3′-CGTTGTCTTTCCTTCACTACTGT-5′；IL-4：正向引物：5′-GCTATTGATGGGTCACCC-3′，反向：3′-AGGACATGGAACTGCAGGAC-5′；IL-10：正向引物：5′-GGTTGCCAAGCCTTATCGGA-3′，反向：3′-TCGTTCCGTCACCTCGTCCA-5′。

1.9统计学分析 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。

2 结 果

2.1IR大鼠造模结果 共有58只大鼠造模成功，设为IR组。与对照组比较，IR组体重显著升高(P<0.01)，血糖及血清胰岛素、ALT、AST和ALP水平均显著升高(P<0.01)。见表1。

2.2各组血清炎症因子的检测结果对比 与对照组比较，模型组血清中TNF-α 和IL-8水平显著增加，IL-4和IL-10水平显著降低(均P<0.01)。与模型组和HPC组比较，HPC+VC组TNF-α和IL-8浓度显著降低，而IL-4和IL-10浓度显著升高(均P<0.01)。见表2。

2.3各组血清和肝脏中FFA检测结果对比 与对照组比较，模型组血清和肝脏中FFA水平显著增加(均P<0.01)。与模型组和HPC组比较，HPC+VC组血清和肝脏中FFA浓度显著降低(均P<0.01)。见表2。

2.4各组肝组织炎性病理反应对比 与对照组比较，模型组肝细胞存在脂肪变性，血管旁存在大量炎症细胞浸润。与模型组和HPC组比较，HPC+VC组脂肪变性明显减轻，炎细胞浸润显著改善。见图1。

2.5各组肝组织PI3K、AKT磷酸化程度 与对照组比较，模型组肝组织PI3K、AKT磷酸化程度显著增加(均P<0.01)；与模型组和HPC组比较，HPC+VC组肝组织PI3K、AKT磷酸化程度显著降低(均P<0.01)。见图2、表3。

表3 各组肝组织PI3K磷酸化和AKT磷酸化程度

2.6各组肝组织NF-κB蛋白相对表达量 与对照组比较，模型组C-NF-κB蛋白表达量显著降低，N-NF-κB蛋白表达量显著增加(P<0.01)。与模型组和HPC组比较，HPC+VC组C-NF-κB蛋白表达量显著增加，N-NF-κB蛋白表达量显著降低(P<0.01)。见图3、表4。

2.7各组肝组织炎症因子mRNA的表达 与对照组比较，模型组血清中TNF-α 和IL-8 mRNA相对表达量显著增加，IL-4和IL-10 mRNA相对表达量显著降低(均P<0.01)。与模型组和HPC组比较，HPC+VC组TNF-α和IL-8 mRNA相对表达量显著降低，IL-4和IL-10 mRNA相对表达量显著升高(均P<0.01)。见表4。

3 讨 论

糖尿病发生IR时，各种毒性物质、代谢物、微生物易引起肝细胞损伤、炎性细胞聚集导致非酒精性脂肪性肝病、肝细胞性肝癌等系列肝损害〔12，13〕。肝脏炎症因子水平会影响胰岛素介导的分子信号通路，造成代谢障碍而呈现胰岛素敏感性降低〔14〕。

FFA作为一种内分泌介质，可以有效调节胰岛素敏感性和糖脂代谢。机体摄入能量过剩时，会在体内以脂肪的形式进行储存，若正常的生理不能调节这些过多的脂肪时，大量的FFA从脂肪细胞中溢出，机体中异常增多的FFA会刺激脂肪细胞释放TNF-α和IL-8等促炎症性因子，这些炎症因子与脂肪细胞因子的受体和模式识别受体结合而干扰机体中糖脂的正常代谢，使机体的胰岛素敏感性降低，诱发IR，呈现糖脂代谢紊乱状态〔15〕。有研究表明，糖尿病患者发生肝损伤时，活性氧簇可诱导肝组织释放TNF-α和IL-8等促炎症因子，TNF-α通过干扰线粒体呼吸链，并且形成超氧阴离子而增加线粒体膜的通透性，从而加剧线粒体损伤〔16〕；TNF-α可以诱导IL-8的产生，IL-8具有明显的趋化和激活中性粒细胞，引起血管内皮细胞损伤，使肝脏炎症细胞浸润更加严重〔17〕。本实验结果表明，HPC+VC可显著降低血清中促炎因子TNF-α和IL-8的水平，改善炎细胞浸润，减轻肝细胞脂肪变性，降低肝组织损伤程度，调节糖脂代谢功能，作用效果优于单独使用HPC或VC。而IL-4和IL-10属于抗炎性因子，其对于调控炎症反应具有重要意义。NF-κB活化可引起众多炎症介质发生作用，活化后的NF-κB由细胞质转移到细胞核内，影响TNF-α和IL-8等基因的转录和表达，诱发各种炎症反应，活化的PI3K/AKT/NF-κB信号通路可直接或间接促进肝脏炎症的发生发展。本研究结果说明HPC+VC能有效阻断PI3K/AKT/NF-κB信号通路、抑制NF-κB活化，进而降低TNF-α、IL-8的浓度，改善肝脏炎症损伤。可以推测HPC+VC联合用药可能通过PI3K/AKT/NF-κB分子信号通路改善IR大鼠的肝脏炎症反应，又因为HPC和VC均为食物中的天然营养成分，无毒副作用，有一定的药物开发和研究价值。

综上，HPC+VC联合用药可明显改善IR大鼠的肝脏炎症反应，但HPC+VC用药后如何作用于受体来调控PI3K/AKT/NFκB分子信号通路，目前分子机制还不清楚，还需进一步研究。