miRNA-330在宫颈癌组织中的表达及对癌细胞活性的影响

季印华，张 蓓，2

(1.徐州医科大学徐州临床学院，江苏 徐州 221004；2.徐州市中心医院，江苏 徐州 221009)

宫颈癌发病是一个多阶段、多基因参与的过程，探究宫颈癌发病机制对提高临床诊治水平具有重要意义[1].近年来研究[2]发现，微小RNA(miRNA)在细胞增殖、分化、凋亡以及肿瘤发生发展过程中有重要的调控作用.miRNA-330在不同类型的肿瘤中表达水平存在一定差异，已有研究[3-6]显示，miRNA-330在乳腺癌、肺癌中高表达，在结肠癌、胃癌中低表达；关于miRNA-330在宫颈癌中表达特点的研究报道仍十分少见.缺氧诱导因子-1α广泛表达于肿瘤组织中，其参与调控肿瘤细胞的增殖、侵袭其及肿瘤组织血管生成等过程[7].使用靶基因预测软件分析显示，miRNA-330与缺氧诱导因子-1α蛋白存在靶向关系，但相关调控机制仍未明确.本研究主要探讨miRNA-330在宫颈癌组织中的表达及对癌细胞活性的影响.

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2019年4月—2020年6月徐州市中心医院收治的宫颈癌患者70例，年龄35～78岁，平均(56.03±6.81)岁.所有患者均接受手术治疗或宫颈活检，病理学检查确诊为宫颈癌，术中采集宫颈癌组织标本和癌旁组织标本，常压下-196 ℃保存.另收集因子宫肌瘤而切除全子宫者50例，年龄41～77岁，平均(55.18±5.26)岁，采集的子宫肌瘤肌层纤维组织标本立即放入-80 ℃液氮中保存.年龄在宫颈癌患者与子宫肌瘤患者之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性.本研究经医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书.

1.2 材料与试剂

人宫颈癌细胞株CCL-2(武汉普诺赛生命科技有限公司)；RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清(南京中科世康生物有限公司)；脂质体2000转染试剂(北京沃比森科技有限公司)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(上海海方生物有限公司)；CCK-8检测试剂盒、Transwell小室(南京贝斯特生物有限公司)；鼠抗人缺氧诱导因子-1α单克隆抗体、鼠抗人β-catenin单克隆抗体、鼠抗人Ki-67单克隆抗体、兔抗人Caspase-3单克隆抗体、鼠抗人GAPDH单克隆抗体以及相对应的二抗(北京沃卡威生物有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 细胞培养与转染

使用含10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基，在CO2细胞培养箱中进行人宫颈癌细胞株CCL-2传代培养.取对数生长期的人宫颈癌株CCL-2，按照脂质体2000转染试剂说明书中的方法将miRNA-330空载体质粒(空载体组)、miRNA-330-inhibitor质粒(miRNA-330-inhibitor组)转染至细胞中，未转染的细胞作为空白对照组.调整3组细胞浓度为1×105/mL，接种在6孔板中，2 mL/孔，置于CO2细胞培养箱中培养，观察细胞融合度40%～50%时用于转染，转染完成后在室温下静置30 min，置于CO2细胞培养箱中培养6 h，然后置于含10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养基继续培养48 h用于实验.

1.3.2 组织和细胞中miRNA-330表达检测

使用RNA提取试剂盒获得宫颈癌组织、癌旁组织、子宫肌瘤组织以及空白对照组、空载体组、miRNA-330-inhibitor组宫颈癌细胞的总RNA，反转录得到cDNA，由上海生工生物工程技术有限公司设计并合成目的基因miRNA-330和内参基因U6的引物，miRNA-330序列：上游引物：5′-CTCT TTCCGTTCACCTA CA-3′，下游引物：5′-CCAGT ATCGACGGGAACT-3′.内参基因U6序列：上游引物：5′-GATATCACAGTGGATTAGCTA-3′，下游引物：5′-GGGAT ATACTACGAG CATAAT-3′.反应体系和参数按照试剂盒说明书设置，进行RT-PCR检测miRNA-330表达水平.

1.3.3 细胞存活率检测

使用0.25%的胰蛋白酶消化空白对照组、空载体组、miRNA-330-inhibitor组细胞，调整细胞浓度为1×103/mL，接种到96孔板中，200 μL/孔，设置8个复孔；同时设置正常培养的宫颈癌细胞株CCL-2为正常对照组.将各组细胞置于CO2细胞培养箱中培养48 h后，加入CCK-8溶液，10 μL/孔，继续培养2 h，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度值，计算细胞存活率：细胞存活率=研究组细胞吸光度值/正常对照组细胞吸光度值×100%.

1.3.4 细胞迁移和侵袭能力检测

采用划痕实验检测细胞迁移能力.取空白对照组、空载体组、miRNA-330-inhibitor组细胞接种到6孔板中，每孔1×105个细胞，每组均设置8个复孔，共使用4块6孔板.观察细胞融合度90%时进行垂直划痕，置于CO2细胞培养箱中培养24 h，观察划痕宽度变化，测量面积并计算划痕愈合率.

采用Transwell小室实验检测细胞侵袭能力.将Matrigel基底胶经RPMI-1640细胞培养基稀释后加入上室中(50 μL)，再将空白对照组、空载体组、miRNA-330-inhibitor组细胞接种到上室中(105个)；根据分组向下室加入相应的细胞培养基，置于CO2细胞培养箱中培养24 h，结晶紫染色，显微镜下计数进入下室的细胞数量.

1.3.5 各组细胞缺氧诱导因子-1α、β-catenin、Ki-67、Caspase-3蛋白检测

取空白对照组、空载体组、miRNA-330-inhibitor组细胞，提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度.根据试剂盒说明书按比例制备浓缩胶和分离胶，将蛋白样品与缓冲液混匀(1∶1)，取变性后的蛋白进行10% SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，室温下封闭2 h、加入鼠抗人缺氧诱导因子-1α单克隆抗体(1∶700稀释)，鼠抗人β-catenin单克隆抗体(1∶500稀释)、鼠抗人Ki-67单克隆抗体(1∶500稀释)、兔抗人Caspase-3单克隆抗体(1∶200稀释)、鼠抗人GAPDH单克隆抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃冷藏过夜，之后加入对应的二抗(1∶1 000稀释)，ECL显影，应用自动凝胶成像系统采集图像.

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 不同宫颈组织中miRNA-330及缺氧诱导因子-1α蛋白表达水平

本研究结果显示，miRNA-330及缺氧诱导因子-1α蛋白表达水平在不同宫颈组织间比较差异均具有统计学意义(P<0.01)；宫颈癌组织中miRNA-330表达水平明显高于宫颈癌旁组织和子宫肌瘤组织，缺氧诱导因子-1α蛋白表达水平明显高于宫颈癌旁组织和子宫肌瘤组织(P<0.01).见表1.

表1 不同宫颈组织中miRNA-330及缺氧诱导因子-1α蛋白表达水平

2.2 各组宫颈癌细胞中miRNA-330及缺氧诱导因子-1α蛋白表达水平

本研究结果显示，miRNA-330-inhibitor组细胞中miRNA-330表达水平明显低于空白对照组和空载体组(P<0.01)；miRNA-330-inhibitor组细胞中缺氧诱导因子-1α蛋白表达水平明显低于空白对照组和空载体组(P<0.01)；miRNA-330及缺氧诱导因子-1α蛋白表达水平在空载体组与空白对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表2.

表2 各组宫颈癌细胞中miRNA-330及缺氧诱导因子-1α蛋白表达水平

2.3 各组宫颈癌细胞存活率

本研究结果显示，miRNA-330-inhibitor组细胞存活率明显低于空白对照组和空载体组(P<0.01)，细胞存活率在空载体组与空白对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表3.

表3 各组宫颈癌细胞存活率

2.4 各组宫颈癌细胞迁移和侵袭能力

本研究结果显示，miRNA-330-inhibitor组细胞迁移率和侵袭率明显低于空白对照组和空载体组(P<0.01)，迁移率和侵袭率在空载体组与空白对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表4.

表4 各组宫颈癌细胞迁移和侵袭能力

2.5 各组宫颈癌细胞中β-catenin、Ki-67、Caspase-3蛋白表达水平

本研究结果显示，miRNA-330-inhibitor组细胞中β-catenin、Ki-67蛋白表达水平明显低于空白对照组和空载体组，Caspase-3蛋白表达水平明显高于空白对照组和空载体组(P<0.01)，β-catenin、Ki-67、Caspase-3蛋白表达水平在空载体组与空白对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).见表5、图1.

表5 各组宫颈癌细胞中β-catenin、Ki-67、Caspase-3蛋白表达水平

1.空白对照组；2.空载体组；3.miRNA-330-inhibitor组.

3 讨 论

miRNA是一类长度约为22个核苷酸的单链非编码RNA，通过降解或抑制靶基因表达，在转录水平上调控基因表达[8].近年来研究[9]发现，miRNA参与胚胎发育、器官形成等多种生理过程；同时miRNA还能够界定分化肿瘤，与胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关[10].miRNA-330是近年来发现的一种miRNA，在肿瘤中的作用仍未明确.在不同研究报道中，miRNA-330在恶性肿瘤发生与发展过程中的作用存在差异.相关研究[11]显示，miRNA-330在乳腺癌、肺癌中表达上调，但在结肠癌、胃癌中表达下调.不同表达状态说明miRNA-330可能在不同肿瘤中发挥不同作用.本研究结果显示，宫颈癌组织中miRNA-330表达水平明显高于宫颈癌旁组织和子宫肌瘤组织，提示miRNA-330高表达可能影响了宫颈癌的发生与发展.

疾病发展中miRNA的调控机制可能与其下游的靶基因有关，使用靶基因预测软件测试结果显示，缺氧诱导因子-1α蛋白是miRNA-330的一个靶基因.缺氧诱导因子-1α是机体在缺氧状态下分泌的转录因子，在乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤中高表达，参与调控肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭过程[11-12].本研究结果显示，宫颈癌组织中缺氧诱导因子-1α蛋白高表达，miRNA-330-inhibitor组宫颈癌细胞中缺氧诱导因子-1α蛋白表达水平明显降低；miRNA-330-inhibitor组细胞存活率明显低于空白对照组和空载体组，迁移率和侵袭率明显低于空白对照组和空载体组.提示宫颈癌细胞中miRNA-330高表达可能通过上调缺氧诱导因子-1α表达，促进细胞存活、迁移和侵袭.进一步通过细胞转染技术下调宫颈癌细胞中miRNA-330表达后，其能够靶向作用于低缺氧诱导因子-1α，降低低缺氧诱导因子-1α表达水平，抑制细胞存活、迁移和侵袭.

细胞增殖和凋亡之间的平衡状态是维持人体生理平衡的关键，Ki-67是细胞增殖的关键调控基因[13]，Caspase-3是细胞凋亡的关键调控基因[14].Ki-67位于人类10号染色体(10q25)上臂的基因编码，表达于细胞增殖的各个时期，与肿瘤细胞的发生发展密切相关[15].Caspase-3是细胞凋亡通路的下游关键调控蛋白酶，正常生理状态下细胞质中Caspase-3以无生理活性的形式存在，当有细胞凋亡信号时，会使Caspase-3出现裂解和活化，活化的Caspase-3参与调控肺癌、结直肠癌等肿瘤细胞的凋亡过程[16-17].Wnt信号通路在细胞间呈自体细胞交流、细胞间交流两种信号传递方式，在遗传学上高度保守[18].Wnt/β-catenin是经典的Wnt信号通路，与肿瘤、骨质疏松等多种疾病密切相关[19].本研究结果显示，miRNA-330-inhibitor组细胞中β-catenin、Ki-67蛋白表达水平明显低于空白对照组和空载体组，Caspase-3蛋白表达水平明显高于空白对照组和空载体组(P<0.05).提示下调miRNA-330表达后能够抑制低缺氧诱导因子-1α表达，降低β-catenin、Ki-67的表达水平，提高Caspase-3的表达水平，抑制宫颈癌细胞的存活、迁移和侵袭，可作为宫颈癌治疗的新策略和靶点.