基因编辑在血管外科中的应用进展

马孝琛，许 鼎，张 恒，刘 鹏，马鹏程，冯 睿，景在平，冯家烜

1 海军军医大学附属长海医院血管外科，上海 200433

2 青岛大学附属医院血管外科，山东 青岛 266100

3 上海市第一人民医院介入中心、血管外科，上海 201600

近年来，基因编辑技术是生物和医疗等诸多领域的研究热点，也是21世纪的生命科学的前沿。得益于基因组测序技术的成熟和发展，人们对庞大而复杂的基因序列有了越来越准确、直观的认识，这为基因编辑提供了必要的数据基础。近年来，基因编辑方法的发展和完善使对基因组的调控和研究成为可能，并且为人类实现基因治疗提供了新的途径[1]。虽然到目前为止，多数疾病的基因治疗仍然处于细胞和动物实验层面，尚未进入临床试验阶段，但是其实验结果所展现出的临床应用前景较为乐观。本综述主要对基因编辑进行总结并对其在血管外科中的应用提出初步设想和展望。

1 DNA 编辑

DNA 编辑是目前研究最多、涉及领域最广的基因编辑类型，根据其可编程核酸酶的DNA 识别模式大致分为两类：通过DNA-蛋白质相互作用实现特定的DNA 位点结合（如锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶和巨核酸酶）、通过RNA引导分子直接与特定靶向DNA序列碱基对结合（如Cas9）[2]。而Cas9由于其稳定性和便捷性而受到人们关注，所以基于成簇规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced palindromic repeats，CRISPR）及其相关蛋白（Cas）系统的碱基编辑逐渐成为DNA 编辑的主要方法。CRISPR系统源自细菌获得性免疫机制，40%的细菌和90%的古核生物拥有内源性CRISPR机制，它使用小RNA通过碱基配对进行识别，并切割外源DNA元件，以序列特异性方式赋予对这些元件的遗传抗性[3]。其中Ⅱ型CRISPR系统在宿主基因组内的CRISPR之间整合入侵的DNA 序列，利用其整合DNA 的特性再经过加工即可作为DNA 编辑的工具[4]。

碱基编辑以在目标靶位引发双链DNA断裂作为基因校正的第一步[2]，但这种方式仍然存在着许多的问题，如在断裂的标靶双链DNA上诱导大量的随机插入和缺失[2,5]，效率较低，只能进行4种碱基转换（C转换为T、G转换为A、A转换为G、T转换为C）而不能进行8种碱基转换（C转换为A、C转换为G、G转换为C、G转换为T、A转换为C、A转换为T、T转换为A、T转换为A）等。在此基础上，Anzalone等[6]发现了一种可以在不断裂双链DNA的基础上进行DNA编辑的新方法——Prime编辑。该方法可以进行全部12种碱基的变换，并显示出比同源定向修复（homologydirected repair，HDR）相似或较高的效率及较少的副产物，与其他碱基编辑相比具有互补的优点，且在已知的Cas9脱靶位点，Prime编辑的脱靶编辑现象低于Cas9核酸酶。Prime编辑扩展了基因组编辑的范围和能力，理论上可以纠正89%与人类疾病相关的已知遗传变异[6-7]。应用上述方法，DNA编辑在血红蛋白疾病（β-地中海贫血，镰状细胞病）、遗传性眼病（Leber 先天性黑蒙）、肌肉遗传病（杜氏肌营养不良症）、遗传性肝病（遗传性酪氨酸血症Ⅰ型，α-1抗胰蛋白酶缺乏症）、先天性遗传性肺病（囊性纤维化，遗传性表面活性蛋白综合征）和遗传性耳聋等方面也有了良好的进展，一些基因编辑药物已经进入临床试验阶段[8]。相关文献表明，将CRISPR-Cas9编辑后的自体CD34+造血干细胞和祖细胞移植到骨髓清除后的输血依赖性β-地中海贫血患者和镰状细胞病患者体内，一段时间后均产生了较好的疗效，这为单基因突变的血液疾病的基因治疗提供了有力的证据[9]。即便如此，由于DNA 编辑是在基因层面上对DNA 序列进行根本性的改变，对于人体来说其安全性方面仍然存在着许多未知的隐患，而且在临床试验中还会有复杂的伦理问题，所以DNA 编辑在疾病的治疗和临床应用方面仍然面临着较大的局限性。与DNA 编辑相比，RNA编辑的发现和研究则较好地解决了这一问题。

2 RNA 编辑

RNA编辑是在RNA水平上对目标RNA进行碱基的精准改变和修饰，其原理与DNA 编辑相似，但其最大的优点在于对基因表达的调控是暂时性的，这就大大增加了其在临床应用方面的安全性和可控性[10]。

自发现微小核糖核酸（microRNA，miRNA）和小干扰核糖核酸（small interfering RNA，siRNA）以来，定点靶向RNA的研究就进入了更加深入的探索阶段，许多利用内源性miRNA和siRNA机制来抑制基因表达的治疗方式出现了[11-12]，但是RNA编辑仍然是一项前沿的新技术。目前研究表明，基于治疗目的，在定点RNA编辑方面，有两种类型的碱基转换是较为有效且能够直接改变密码子并编码RNA，即C转换为U、A转换为I[13]。A到I转换需要作用于RNA的腺苷脱氨酶（adenosine deaminases acting on RNA，ADAR），在哺乳动物体内发现3种与编码碱基转换有关的酶，即ADAR1、ADAR2和ADAR3。其中ADAR1含量最多、分布最广；ADAR2主要在神经、血管和消化系统中表达；ADAR3是大脑特有的，但由于ADAR3不具有酶活性，所以认为ADAR3与其他ADAR酶竞争从而可以发挥调节RNA编辑的作用[14-15]。研究表明，ADAR1是重复位点的主要编辑器，ADAR2是非重复编码位点的主要编辑器，而无催化活性的ADAR3主要充当编辑抑制剂[16]。C转换为U也是由ADAR体外转换的编码[17]，由于编辑的酶与哺乳动物同源，这使得这两种方式在编码的过程中几乎不会引发免疫反应。

近年来，随着对CRISPR 相关系统的深入研究，发现了Ⅵ型CRISPR 核酸酶Cas13，它使得CRISP-Cas 系统的使用从DNA 靶向扩展到RNA 靶向[18-22]。CRISPR系统的靶向特异性由RNA 嵌合体和靶DNA 之间的碱基配对，以及Cas9蛋白与靶DNA 3'端常见的短DNA 基序[原型间隔区相邻基序（protospacer adjacent motif，PAM）]之间的结合决定，PAM 是CRISPR 机制识别的关键基序[3]。由于Cas13是RNA 的靶向，不需要PAM，这就使得其能够融合的靶向空间几乎没有限制[10]，也使得CRISPR 系统的RNA 编辑靶向治疗具有更加广泛的应用前景。

目前RNA编辑已经在动物实验中取得了初步的良好结果。Zhou 等[23]的研究通过RNA靶向的CRISP系统CasRx将小鼠的星形胶质细胞转化为有功能的神经元细胞，这为神经系统疾病（如阿尔茨海默病、帕金森综合征等）的治疗提供了新的方向。

3 基因编辑在循环系统疾病治疗中的进展

由于因编辑技术的完善和进步，通过基因编辑技术治疗遗传性疾病的研究也在逐渐深入并取得了一定的成效。Zhao 等[24]动物实验表明，在小鼠体内腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）CRISPR-Cas 介导的Ldlr基因校正可以部分提高低密度脂蛋白受体的表达，有效改善Ldlr突变体的动脉粥样硬化表型，为家族性高胆固醇血症患者的治疗提供了一种潜在的治疗方法，而高胆固醇血症是动脉粥样硬化等血管疾病的主要危险因素之一。

在循环系统相关遗传疾病的方向上，基因编辑正在成为一颗冉冉升起的新星。研究表明，通过应用Cas对胚胎细胞进行DNA编辑，已经在肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）[25]和马方综合征（Marfan syndrome，MFS）[26]等遗传病的基因治疗中取得了一定进展。

HCM是一种以左心室肥厚和心肌纤维紊乱为特征的心肌疾病，患病率为1 ∶500，临床上常伴有心力衰竭表现[27]。已有研究表明，超过350个位点的肌球蛋白结合蛋白C3（myosin-binding protein C3，MYBPC3）基因突变与HCM有关，占所有HCM突变的40%～50%，使MYBPC3成为HCM中最常见的突变基因[28-29]。Ma等[25]使用CRISPRCas9在人类生殖细胞中成功修正了MYBPC3突变，纯合野生型基因型比例修复比例达到66.7%，且在MⅡ期卵母细胞中注入CRISPR-Cas9比在受精卵中注入具有更有效的靶向作用，表明CRISPR-Cas9可用于消除人类胚胎中的致病突变，并且在胚胎发生过程中通过对Cas9注射时间的修改可显著提高HDR效率。

MFS 是一种与多器官系统异常相关的遗传性结缔组织病，其引发的胸主动脉瘤和主动脉夹层是主要的致死病因，其最常由编码的纤维蛋白-1（fibrillin-1，FBN1）基因的常染色体显性突变引起[30]。Zeng 等[26]研究使用Cas9纠正了胚胎期MFS 致病突变基因FBN1T7498C，通过测序验证了在杂合人类胚胎中成功实现了遗传校正。这一实验结果证明了通过碱基编辑在人类早期胚胎中纠正致病突变的安全性，并为MFS 提供了可能的治疗方法。但对于发育成熟的MFS 患者的血管壁细胞（血管平滑肌细胞、成纤维细胞等）的基因编辑修复效应至今还没有相关报道。

除了遗传性疾病之外，由于高脂饮食和缺少运动的生活方式等原因所引起的肥胖，作为心血管疾病的重要危险因素之一，在基因编辑方面也有了一定的进展。Wang等[31]利用CRISPR编辑技术成功将人类白色脂肪组织转化为高表达解偶联蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）基因的人类褐色脂肪样细胞，并在被移植人类褐色脂肪样细胞的小鼠中观察到体内的白色脂肪比例明显更低、体重也更轻且均接近直接移植褐色脂肪细胞的小鼠。该实验证明了使用CRISPR基因编辑技术改造人类白色脂肪细胞，使其显示褐色脂肪样细胞表型的实用性，为使用基因疗法对抗肥胖症等代谢性疾病提供了新的机会，也为心血管疾病的预防提供了新思路。

4 小结与展望

尽管基因编辑已取得较大进展，但是其存在的问题还是不容忽视。DNA 编辑中碱基编辑方法会引起DNA 双链的断裂从而引起大量碱基的错配、插入、缺失等改变；Prime 编辑不会断裂双链，但却有较高的脱靶效应，无法解决DNA 编辑后的安全问题，且引入CRISPR-Cas9会使机体发生免疫反应。对于许多先天性的遗传病来说，只有在胚胎期进行DNA 编辑才有希望从根本上治疗下一代的遗传病，而这将面临严峻的医学伦理问题，且对于亲代已经存在的因遗传病导致的组织器官的器质性病变作用较小，所以在将来的临床应用场景和适用患者的选择方面有较大困难。相比之下，RNA编辑尽管尚处于探索初期阶段，也存在着一定脱靶效应和免疫反应等问题，但却因其不改变基因结构，仅通过改变DNA 转录后产物RNA来对基因的表达进行调控，从而大大增加了基因治疗的可调控性和安全性，而且已有动物实验证明其在遗传疾病治疗方面的可行性，所以RNA编辑在基因治疗中有着更广阔的临床应用前景。

尽管现在还没有明确的研究将RNA编辑用于血管疾病的基因治疗，但已有的发现表明，转化生长因子-β信号级联和编码平滑肌收缩器的组成部分的基因突变与主动脉遗传疾病密切相关[32]，这些位点的确定也为血管疾病的RNA编辑治疗提供了新的有潜力的研究方向。