前列腺癌靶向超声造影剂的研究进展

王慧杰，红 华，梁丹艳

1内蒙古医科大学内蒙古临床医学院，内蒙古 呼和浩特 010110；2内蒙古自治区人民医院超声医学科，内蒙古呼和浩特010017

前列腺癌（PCa）是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，在西方国家发病率极高，在美国和欧洲的癌症死因中位居第2［1］。据美国癌症协会统计，2020年新诊断的PCa患者超过190 000人，因PCa死亡的人数高达3万人以上［2］。近年来PCa的发病率在大多数亚洲国家呈上升趋势［3］。随着我国居民生活习惯的改变，检查技术的提高以及人口进入老龄化，PCa的发病率也逐年升高，故对于高危群体进行及时干预具有非常重要的意义。

超声分子成像技术使用特定抗体或配体标记成像化合物，生成能够结合特定组织或病变的靶向超声造影剂，静脉给药后，这些分子探针通过血液循环在靶组织中特异性聚集，经超声检查可在分子或细胞水平上对病变区域进行特异性成像。本文就靶向超声造影技术在PCa的诊断与治疗方面的研究进展进行综述。

1 靶向超声造影剂在PCa诊断方面的研究进展

靶向超声造影剂是将靶向生物标记物添加到分子显像剂中的一种技术，配体被设计成黏附在外壳上的内皮生物标志物［4］。靶向造影剂将通过配体-受体黏附到靶组织，在微血管中积累。给药几分钟后进行影像学检查，大部分游离造影剂通过呼吸道排出，靶区的造影剂将会显影，信号强度与生物标志物的表达程度成正比［5］。目前在超声造影剂中常用的PCa靶向配体有以下几种。

1.1 前列腺素1（STEAP-1）

STEAP-1是一种细胞表面蛋白，具有组织特异性，在原发性PCa细胞中高表达，与细胞之间的通讯有关［6］。该抗原有339个氨基酸残基，并以蛇形方式折叠成2个细胞内环和3个细胞外环［7-8］，具有转运蛋白或离子通道的作用，在PCa靶向诊断与免疫治疗方面具有非常广泛的应用［9］。有学者通过生物素-亲和素桥接化学的偶联的方法，将STEAP-1单克隆抗体偶联到声诺维微泡上，使之在体外可以与PCa细胞特异性结合［10］。经实验证实，该微泡可以在裸鼠异种移植模型中与肿瘤表达的靶点结合，增强超声成像信号强度。

1.2 前列腺特异性膜抗原（PSMA）

PSMA又称谷氨酸羧肽酶II。PSMA是一种含750个氨基酸的II型整合膜蛋白，也具有明显的组织特异性，在PCa转移过程中过表达，是一种潜在的PCa成像和治疗的靶蛋白［11］。有学者认为PSMA 可作为PCa 组织显像效果增强及治疗试剂传递的理想靶点［12］，运用该靶点来制备超声造影剂已有报道，许多研究利用PSMA单克隆抗体制备了靶向PCa的超声造影剂，并通过体内外实验验证了其靶向能力，能够实现与PCa 细胞的有效结合。有学者将PSMA抑制剂分子探针与超声微泡（MBs）结合验证其成像与靶向能力［13］，尽管抗PSMA抗体可以增强MBs的靶向性，但由于微米级的造影剂尺寸较大，在血液中弥散度及溶解度均低、半衰期短，只能通过肺循环和毛细血管床，唯有纳米级的颗粒才可跨过肿瘤血管到达位于血管外的目标组织。有学者研发出的纳米级载PSMA-1抗原的纳米微泡（NBs）直径均小于300 nm，边缘激活剂丙二醇的加入使NBs体积更小，并增加了外壳变形能力，可使其通过肿瘤新生血管，延长了显影持续时间［14］。

目前用于研究的抗-PSMA 配体有许多，它们大致可分为3类：抗体、适体和配体［15］，其中核酸适体是一些能特异性结合蛋白质或其他小分子的核苷酸片段，这些片段是通过体外SELEX筛选技术得到的，它们与目标配体的亲和力和特异性均较高［16］，由于RNA核酸由核苷酸组成，结构变异多，特异性强，常用于分子成像和基因治疗［17］；此外，核酸作为靶向探针可以避免疫原性，且其纯度高，比其他配体更安全［18］。有研究使用的A10-3.2适配体由37个核苷酸组成，相比早期适体如A10、A9，分子量大大降低，提高了其靶向能力，利用该适配体结合聚乙二醇对无机材料多壁碳纳米管进行修饰，制备出的NBs相比于只利用有机物为原料的NBs具有更好的可视性和准确性［19］。

1.3 血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）

VEGFR2的表达在内皮细胞增殖和迁移的信号级联中起着关键作用，可促成肿瘤血管的生成和进展。与良性增生或正常腺体组织相比，PCa组织中的VEGFR2呈现出过表达的趋势［20］。携带VEGFR2的超声造影剂，可特异性靶向于PCa的新生血管，有学者通过动物实验证实该靶向特异性造影剂在早期流入分析和肿瘤组织内的特异性积累方面均优于非特异性的普通造影剂［21］。BR55是一种VEGFR2特异性超声分子造影剂，首次进行的BR55的0期临床实验结果表明，其具备良好的成像效果与安全性［22］。

其他前列腺特异性靶向配体也显示出精准的造影效果。有学者开发出一种载有CUB结构域蛋白1受体的靶向型超声造影剂，先使用PLGA12k-mPEG2k-NH2、DSPE-mPEG2000和液体氟碳全氟己烷合成非靶向纳米颗粒，再与抗CUB结构域蛋白1抗体结合形成抗CUB结构域蛋白1非靶向纳米颗粒，经体外实验结果表明，其造影效果和肿瘤靶向性均良好［23］。

2 超声靶向造影剂在PCa治疗方面的研究进展

MBs低频低强度超声（LFUM）可以干扰肿瘤新生血管的生成，可用于解决与肿瘤转移和放化疗耐药性有关的一系列问题［24］。超声靶向造影剂还可以作为基因与药物的载体。基因与药物的传递依赖于超声靶向微泡破坏（UTMD）。LFUM与UTMD的原理是声空化，即微气泡振荡时，可导致小血管的机械损伤和微泡变形破裂，从而释放基因与药物［25］，作用于肿瘤组织。还有相关研究表明，微泡壳的材料种类也可以直接影响细胞的通透性，例如磷脂微泡与细胞之间的脂质交换机制可以在体外显著提高药物传送的效率，并可通过适当调节脂质分子的碳链长度和形状（圆柱形或锥形）来促进声孔效应［26］。

2.1 诱导血管损伤和肿瘤细胞凋亡

肿瘤血管生成的定义是当肿瘤＞1 mm3或细胞数＞1×107时，微血管网通过内皮细胞开始形成新的血管，为肿瘤细胞增殖提供足够的氧气和营养成分［27］。

PCa生长和转移依赖于肿瘤微血管的形成。由于新生的血管缺乏弹性纤维层，基底膜不完整，血管壁脆性和通透性高。因此，抗血管生成和阻断肿瘤血供已成为肿瘤治疗的新途径。超声造影技术不仅在显示肿瘤微血管方面具有独特的优势，而且可以降低超声空化效应的阈值，增强空化效应，从而破坏血管壁，激活内源性或外源性凝血，导致大量毛细血管栓塞，阻断肿瘤细胞的营养供应，导致肿瘤细胞凋亡［28］。低频超声对肿瘤血管的损伤还可以增加抗癌药物的摄入，增强癌细胞的细胞毒性和死亡率。与微泡联合使用时，可增强化疗药物的疗效，从而减少药物的用量和副作用。在超声和微泡介导下与抗癌药物组合可通过增加膜通透性来增强化疗效果［29］。有研究表明，多西他赛与超声微泡的联合治疗，可使多西他赛的抗肿瘤作用显著增强［30］。

LFUM阻断血流的作用对PCa缺氧环境也存在一定的影响。有研究使用LFUM和MBs对PCa肿瘤进行不同次数的辐照，结果显示，若每个治疗日进行4次辐照，则细胞增殖受到抑制，促进细胞凋亡，治疗组的低氧诱导因子1α和血管内皮生长因子A的表达水平均低于对照组；当每个治疗日进行1次辐照，则刺激缺氧反应，促进细胞增殖，缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子A的表达水平则高于对照组［31］。总之使用LFUM作为抗肿瘤的方法是一个复杂的过程，相同条件下，不同时间的辐照对缺氧反应的影响是不同的，验证LFUM对肿瘤血供阻断作用的同时，也需要评估肿瘤组织的缺氧环境。

2.2 基因转染

基因转染对PCa的治疗具有很大的前景［32］。目前基因转染的方法有两种：病毒载体基因转染和非病毒载体基因转染。以病毒作为载体可能会诱发一些免疫反应，非病毒载体虽相对安全，但其转染率较低［33］。如前所述，低频超声可以促使MBs迅速破裂，空化效应产生的冲击波可增加区域内毛细血管和周围组织细胞膜的渗透性，使细胞外大分子进入细胞，所以超声结合MBs可能成为一种高效的基因治疗方式。有学者设计实验观察评估了在80 kHz超声辐照下pEGFP基因转染的PCa细胞膜的连续性和转染效率，证实了低频超声联合MBs可作为一种促进PCa细胞基因转染的方法［34］。

MicroRNA是一种非编码小RNA，通过转录后的方式调控基因表达，与肿瘤发病机制有关［35］。有学者将与PCa发生相关的miR-205包裹于微泡中，通过实验表明UTMD 介导的miR-205 转染抑制了PCa 细胞的增殖、迁移和侵袭，且介导的miR-205表达可促进顺铂调控的细胞凋亡，增加了肿瘤对化疗的敏感度。此外，UTMD介导的miR-205转染可能会促进PCa细胞凋亡，还可抑制上皮-间充质转化。因此UTMD介导的miR-205传递可能会是一种新的PCa分子靶向治疗方法［36］。

2.3 靶向给药

肿瘤治疗过程中，化疗药物的有效浓度直接影响化疗的效果。传统化疗方式为了加强疗效，通常会加大剂量，从而增加了全身毒副作用。若将治疗PCa的药物加入到靶向超声造影剂中，在超声的辐照下将引发微泡的空化效应和声孔效应，从而使血管壁产生孔隙，亦可导致血管栓塞，使肿瘤细胞损伤，增强药物的疗效。在特异性成像的同时，实现定向给药，提高局部药物浓度，减少副作用［37］。

姜黄素是一种从姜黄属植物中提取的天然多酚分子，对肿瘤具有抗增殖与促凋亡的作用［38］，但其水溶性差，生物利用度低。将姜黄素包裹到以葡萄糖为外壳的NBs中，在PC-3和DU-145细胞系中检测到显著的生物学效应，证实了其能够抑制肿瘤细胞粘附和迁移［39］，弥补了单一进行药物治疗的不足。有学者开发出以凝块结合肽半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸（CREKA）肽修饰的包载多西他赛脂质体（CREKAlipo-DTX），即CREKA肽作为靶向配体，装载多西他赛作为治疗药物，药物可定向于PCa细胞发挥作用［40］。有学者将药物与基因共同包裹于NBs中，也展现出不俗的治疗效果，化疗药物阿霉素（DOX）和靶向生存素的小干扰RNA载入微泡-脂质体复合物中，该复合物可与抗人表皮生长因子受体2型抗体结合，对PCa细胞具有靶向作用，实验表明微泡-脂质体复合物介导靶向生存素小干扰RNA和DOX的转染可诱导PCa细胞凋亡，阻断生存素在体内外的表达［41］。

2.4 多模态与其他治疗手段的联合

MRI对PCa有重要的诊断价值，MRI在三维空间具有软组织对比分辨率高以及多序列多参数成像的优势，但无法对周围叶的低信号炎性结节和增生结节进行准确区分，有学者使用飞利浦Percunav系统将MRI序列中T2加权图像的感兴趣区域与实时超声图像进行叠加，发现超声造影图像与MRI图像融合有助于发现PCa病灶［42］。有学者研发出一种超声响应双模态US/T1-MRI造影剂，即Fe3+MNPs，该NBs除了可以通过超声实时探测PCa病灶，还可以在T1-MRI图像上得到增强的肿瘤影像。此外为了选择性地靶向于过表达PSMA的PCa 病灶，在Fe3+MNPs 上引入了一种多肽—WQPDTAHHWATL，实验表明MB+Fe3+MNPPs在超声与MRI中具有良好的靶向造影效果［43］。

传统的根治性治疗（手术或放疗）对早期PCa患者可能会造成不必要的损伤。光热转导剂具有光热效应，可将光能转换为热能，注入体内后经过特定波长的光源照射，可提高肿瘤区域的温度引发癌细胞的死亡，这种治疗方法即光热疗法［44］。光动力疗法是指将生物惰性药物即光敏剂暴露在光照下，经过一系列能量转化和化学反应，最终生成活性氧，可破坏肿瘤细胞［45］。光热疗法与光动力疗法作为一种安全有效的低风险的焦点疗法，可用于局限性PCa的治疗。有学者研发出环精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽修饰的负载吲哚菁绿的微泡，可用于超声-光声成像和协同光热疗法治疗［46］。有学者将负载吲哚菁绿的NBs 内加入化疗药物紫杉醇，在实现超声、光声、荧光等多模态成像的同时，可在肿瘤组织处释放药物，增强药物疗效［47］。上述NBs虽然可以依赖高渗透长滞留效应在肿瘤组织中聚集，但不具备主动靶向能力，可能会引起药物利用率低等问题，遂有学者在多功能纳米平台中添加了PCa特异性靶向抗体，有研究等制备了多功能类黑色素聚多巴胺（PDA）纳米载体，其表面装饰有小分子PSMA抑制剂N-［N-［（S）-1,3-二羧基丙基］氨甲酰］-（S）-l-赖氨酸（DCL），然后将PDA-DCL与全氟戊烷（PFP）功能化，并负载光敏剂氯e6（Ce6）合成Ce6@PDA-DCL-PFP，该药物有较强的主动靶向能力，可用于PCa的超声引导光动力/光热联合治疗［48］。

此外，有学者开发出的治疗性光声多模态MBs，将抗癌药物DOX插入siVEGF的双链复合物中，为了避免在光动力过程中导致小干扰RNA失活，在结构上使DOX-siVEGF-NPs和光敏剂氯蛋白e6-MBs分离，其作为化疗-光动力-基因联合治疗的新型载体具有很大的潜力，或许可以用于PCa靶向多模态成像与治疗，解决光动力疗法联合治疗的局限性和药物传递效率低的问题，为今后的研究工作提供了思路［49］。近年来还有研究者尝试使用新型材料制作NBs外壳，制备出金属-有机骨架材料衍生的双层中空二氧化锰纳米颗粒，在超声波的辐照下可以产生出大量活性氧，用于多模态成像引导声动力治疗，同时二氧化锰纳米颗粒产生的活性氧也可以增强超声显影，为今后的研究指引了新方向［40］。

3 展望

靶向PCa超声造影技术在PCa诊疗方面具有很大的应用价值，其检查方式便捷，可实时监控病灶的增强方式，携带药物或基因进行特异性治疗，尤其是对于一些早期病灶的诊断和晚期的癌症治疗。超声造影剂结构特殊，可修饰性强，近年来研究工作者将靶向微泡造影技术与其他检查和治疗手段相结合，制备出多模态成像的造影剂，或者通过包裹一些特殊物质实现联合光热疗法和声动力疗法等，均展现出不俗的诊疗效果。目前靶向超声造影剂的研发也具有许多局限性，首先是造影剂的粒径，目前临床常用的造影剂大多属于微米级别，纳米级的造影剂只在体外或动物实验中研究；其次NBs的相变条件和温度的调控，需要参考人体可耐受的温度与频率等条件来探索制备材料与方式；进行靶向诊疗的同时也需要兼顾减少对正常组织的损伤。由于人体与动物之间存在差异性，将需要更多的临床实验和安全性评价，或者更多的发掘一些新型材料的特点与优势，使诊疗一体化的纳米靶向造影剂应用于临床。