NLRP3炎症小体在热应激损伤中的作用研究

杨丽丽 李 斌 倪海东

（南通大学附属医院儿科 南通 226001）

小儿热性惊厥（Febrile Seizures，FS）主要是因为发热所引起的，对于6个月-5岁的幼儿有着较高的发病率[1]。尤其是在我国的南方地区，发病率达到了16%。关于FS的发病机制，主要是由于异常过度放电引起[2]，所以是难以进行预测的，主要的诊断手段为影像学、脑电波记录、腰椎穿刺等等，这些都是属于有创诊断，会对患儿的身体造成较大伤害。由于缺少FS治疗手段，所以在临床上往往是通过药物缓解症状，但是具有一定的副作用[3]。炎症小体是胞浆当中的多蛋白复合物，可以对受体进行识别以及危险信号传导，激活下游级联反应。相关研究表明，NLRP3炎症小体在很多疾病当中都会产生炎症反应[4]。本文基于此，对NLRP3炎症小体在热应激损伤中的作用进行了研究。研究报告如下。

1 材料与方法

1.1 设备

生物超净台DMEM培养基（美国Hcyclone），胎牛血清（美国GIBCO），青链霉素（美国GIBCO），MTT（美国GIBCO），DMSO（美国Sigma公司），苏木精-伊红染液（上海舜田生物有限公司）[5]。

1.2 方法

选择2019年5月1日-2021年11月1日在南通大学附属医院就诊的90例6月-6岁FS患儿作为热性惊厥组(FS组)，其中单纯性热性惊厥患儿（SPS）52例，复杂性热性惊厥患儿（CFS）38例。选择同一时期到我院进行健康体检的25例健康儿童作为对照组。通过PCR的方法对外周血NLRP3、ASC和Caspase-1mRNA的表达进行检测，通过ELISA法检测患者外周血IL-1β、IL-6， TNF-α、NSE表达水平进行检测。纳入标准：FS诊断标准:根据第八版《诸福棠实用儿科学》，并最终确诊原发病为急性上呼吸道感染[6]。CFS入选标准:长时间的惊厥发作，持续时间≥15min；丛集式发作，24h内反复发作≥2次；局灶性发作，且热退1周后有脑电图异常；反复频繁的惊厥发作，累计发作总次数≥5次。具备上述1条即可诊断为CFS。排除标准：1)有原发性的颅脑损伤患儿；2)有颅内感染的患儿；3)CT/MRI检查有异常的患儿；4)确诊癫痫的患儿；5)维生素D缺乏低Ca性抽搐；6)其他电解质紊乱引起的抽搐；7)代谢性疾病引起的抽搐；8)出生为早产儿或过期产儿[7]。

建立FS动物模型，选择20只SPF级别周龄2周的正常SD大鼠作为研究对象，通过热水浴诱导惊厥的方式进行建模，FS5级行为评分标准进行评分。共分为五级，症状从轻到重[8]。使用RIPA裂解液对蛋白进行裂解，温度为4℃，在12000g下离心15min，静置10min后取上清液，按照每孔30ug进行蛋白分离。最后，为了探讨NLRP3炎症小体抑制剂在反复FS当中的保护作用，将大鼠分为FS组（n=10）、FS+NLRP3炎症小体抑制剂组（n=10），在热水浴槽当中进行诱导，观察惊厥行为的特征，若出现跌倒或者痉挛，将其当做第一次的惊厥发作，并讲放入热水浴槽到惊厥发作的时间进行记录，发作惊厥后放入常温平板中进行休息，休息时间5min，随后重新放入热水浴槽，若再次出现惊厥行为，将其当做第二个发作。实验时长为55min，若没有发生惊厥性为，则当做未出现惊厥发作。诱发惊厥 2次/d，共 10次。比较两组潜时。

2 结果

2.1 两组患儿外周血相关数据变化

将两组患儿的外周血相关数据变化进行记录。研究结果表明，FS组患儿的IL-1β、IL-6、NLRP3、TNF-α明显升高，且相较于正常对照组，具有统计学差异（P＜0.05）。具体数据如表1所示。

表1 两组患儿外周血相关数据变化

2.2 大鼠模型实验结果

将大鼠分为FS组和FS+NLRP3炎症小体抑制剂组，对大鼠进行热水浴模型测试，观察两组大鼠的惊厥发作潜时。研究结果表明，FS组大鼠的潜时明显低于FS+NLRP3炎症小体抑制剂组，且在数据的对比中具有统计学差异（P＜0.05），如表2所示。

表2 两组大鼠惊厥行为潜时对比

2.3 两组大鼠在不同时间的生存率比较

将两组大鼠在不用时间内的生存率进行比较，研究结果表明，1小时内，两组大鼠的生存率无明显差异（P＞0.05），在2小时后，两组大鼠的生存率具有明显差异，在平均生存时间上也具有统计学差异（P＜0.05）。具体数据如表3所示。

表3 两组大鼠在不同时间的生存率比较（%）

3 讨论

当前关于热应激损伤的发病机制还不是很完善，这与儿童神经系统的发育功能有着密切的关系，由于神经系统的发育功能不完全，导致神经元的微环境受到了影响[9]。相关研究表明，FS的发生与呼吸性碱中毒有关，随着患儿体温的升高，会导致机体通气过度，提高二氧化碳的浓度，直接引起呼吸性碱中毒[10]。由于高热所引起的炎症对幼儿的生活质量造成了较大的影响，高热相关的因子包括白介素-1β（IL-1β）、白介素-1α（IL-1α）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）等[11]，这些因子的表达在热惊厥患者中都有明显的提高。在某项大鼠模型研究中，缺乏IL-1β受体的大鼠更加耐受热惊厥，说明IL-1β参与到惊厥的发生中。随后对周龄为2周的大鼠注射红藻氨酸[12]，从而建立热惊厥模型，结果表明IL-1β在热性惊厥中有潜在的发生作用。NLRP3炎症小体是由NLRP3、ASC、pro-caspase-1所组成[13]，是一种多聚体的蛋白复合物。在受到高热的刺激之后，炎症因子会启动[14]。细胞受到高热影响时，细胞当中的识别受体PRRs（Pattern Recognition Receptors）会与结合分子ASC、NLRP3、caspase-1组成完整的炎症小体。NLRP3炎性小体能使磷酸化caspase-1去磷酸化，活化的caspase-1促进 IL-1β、白介素-18 ( IL-18) 炎性因子前体的成熟，由此可见 NLRP3 炎性小体活化是IL-1β成熟的关键。尽管临床研究及动物实验均证实IL-1β在热性惊厥中表达上调，但是目前国内外尚没有关于NLRP3炎症小体与小儿热性惊厥的发作关系研究的报道[15]。

本文基于此，对NLRP3炎症小体在热应激损伤中的作用展开了研究。研究结果表明，热性惊厥组患儿，尤其是复杂性热性惊厥患儿（CFS）的IL-1β、IL-6、NLRP3、TNF-α有明显的升高，相较于正常对照组具有统计学差异。在大鼠模型的研究中，FS组大鼠惊厥潜时明显低于FS+NLRP3炎症小体抑制剂组，表明有了抑制剂的加成，大鼠的惊厥潜时增加，惊厥次数较少。在不同时间内大鼠生存率的比较中，1小时内两组大鼠的生存率无明显统计学差异，在两小时后，FS+NLRP3炎症小体抑制剂组的大鼠潜时明显高于FS组，且在平均生存时间上高于FS组，具有统计学差异。

综上所述，NLRP3炎症小体会参与到热应激损伤中，会对NLRP3炎症小体进行抑制，并且提高大鼠的生存时间。可提高患儿的IL-1β、IL-6、NLRP3、TNF-α等相关指标，增加大鼠模型的惊厥潜时，且NLRP3炎症小体的激活与IL-1β有着密切的关系。是热应激损伤中非常重要的指标之一，需要重视。