红景天苷对热射病大鼠的心功能损害机制研究

肖 辉 李俊敏

(1 湖北医药学院附属十堰市太和医院,十堰,442000; 2 湖北医药学院附属十堰市人民医院,十堰,442000)

热射病为中暑症状较为严重的一种，以高热、昏迷为主要临床表现，研究数据统计，其早期死亡率高达70%[1]。引起热射病因素较多，主要为高温、大量体力劳动等，高温条件下热量易传入人体，增加了机体代谢热量，导致机体自身防御功能无法与热应激反应对抗，继而使得体温升高，对心脏功能产生直接损害，诱发多器官功能衰竭，最终面临死亡[2-3]。红景天其主要成分为红景天苷，发挥抗疲劳、抗缺氧、益气活血功效，已有越来越多的研究证实，红景天苷对降低心肌氧化应激反应发挥重要作用，可对心脏功能进行有效保护[4-5]。本研究以40只大鼠为对象,分作4组,予以不同干预,旨在进一步探讨红景天苷对热射病大鼠心功能损害的保护作用与机制,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)级雄性SD大鼠共40只,体质量190～210 g,平均体质量(200±10)g,由广州中医药大学实验动物中心提供,生产许可SCXK(沪)2021-0004,单位:上海亓上生物医学科技有限公司。饲养条件：饲养条件:设置40%～70%湿度，18～22 ℃温度，黑暗、照明环境下分别放置12 h，自由饮水、进食(伦理审批号:JN.No20191030b0601231)

1.1.2 药物 4、8、32 mg/kg红景天苷(陕西森悦生物科技有限公司,批号:b1303)。

1.1.3 试剂与仪器 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)剂盒(上海源叶科技有限公司,批号:S10115-15KU)、丙二醛(Malonaldehyde,MDA)试剂盒(上海沪峥生物科技有限公司,批号:HS4639)、BCA蛋白试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司,批号:BI-WB005-200T)、二甲亚砜(广州勤必发商贸有限公司,批号:PV6210000)、双氯荧光黄乙酸乙酯(北京华威锐科化工有限公司,批号:C34725)、嵌段式聚醚F-127(Sigma公司,批号:9003-11-6)。线粒体分离试剂盒(武汉卡诺斯科技有限公司,批号:B30142)、细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒[凯基生物科技有限公司,批号:ImmunoChemistry(ICT)_97]。线粒体呼吸控制率定量检测试剂(深圳子科生物科技有限公司,批号:GMS10097)。红景天苷(中国食品药品生物检定研究院,批号：110818-201708)。离心机(海安亭科学仪器厂,型号:L3202),PCR仪(Advanced Bionics,美国,型号:ABI-7500),透射电镜(日立公司,日本,型号:H-7500)，计算机控制大鼠转轮式跑步机(上海欣软信息科技有限公司,型号:YLS-15A),流式细胞仪(BD公司，美国,型号：FACS Calibur)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 依据干预方式不同将40只大鼠分为对照组,红景天苷干预作低剂量、中剂量、高剂量组，每组10只。

在设定好的湿度与温度下大鼠在跑步台上跑步，设定跑步机坡度为0度，速度为15 m/min。若中途大鼠停止跑步，则以电压100 V的电击，直至大鼠力气耗尽。之后，再次给予电刺激，致使大鼠瘫软在平面上不能自主翻身。判断大鼠热射病主要依据为：大鼠动脉收缩压升高至顶点后呈降低趋势，直至拐点，或内核温度升高至42.5 ℃。

1.2.2 干预方法 对照组建模后予以常规饮食饲养;低剂量组予以4 mg/kg红景天苷;中剂量组予以8 mg/kg红景天苷;高剂量组予以32 mg/kg红景天苷。3组给药方式均为填喂法。

1.2.3 检测指标与方法 1)取材。安乐处死大鼠,对其心脏组织进行摘除,通过缓冲液聚丁二酸丁二醇酯(Polybutylene Succinate，PBS)将血渍清洗干净,置入离心管(2 mL)标记,1 500 r/min，离心半径6 cm，离心5 min。于液氮中进行冷冻,保存于-80 ℃冰箱中。2)电镜标本制作与观察。通过PBS液对大鼠心肌细胞进行冲洗,以1%戊二醛、1%多聚甲醛于室温条件下进行1 h固定,通过锇酸于4 ℃条件下固定1 h。以乙醇展开常规多级脱水处理,使细胞内嵌于LX112。切片,通过1%的乙酸双氧铀、柠檬酸铅进行染色处理,于300万倍电子显微镜下对大鼠心肌结构、线粒体形态进行观察。3)检测氧自由基、线粒体膜电位、呼吸控制率。a.线粒体。选取大鼠心脏组织(0.1 g)作为实验标本，PBS液洗涤，吸干,匀浆后研磨处理,600 r/min，离心半径8 cm，离心10 s,离心2次,沉淀物即为线粒体,加入100 μL含1%牛血清白蛋白蔗糖溶液,获取沉淀为线粒体，保存于4 ℃环境中。b.测量线粒体膜电位。应用100 nmol/L的HEPES(含红色荧光)对大鼠心肌细胞进行0.5 h孵育，分析仪器选择流式细胞仪。c.检测线粒体呼吸控制率。介质液加入至反应槽中，密封,并记录氧浓度,将待测线粒体加入,对Ⅲ与Ⅳ态呼吸速率检测，计算呼吸控制率。d.检测线粒体氧自由基。线粒体悬液避光条件下放置15 min，灌洗选择生理盐水，时间控制在45 min作用，之后应用流式细胞仪检测荧光强度，并对结果记录，并对相关数据计算。e.线粒体细胞膜通透性。心肌细胞重悬后,孵育15 min,对激发光波长进行调节,使其为288 nm、543 nm,于40倍物理镜下对成像情况进行观察。4)MDA及SOD测定。检测操作均按照说明书进行。5)过氧化物酶体增殖物激活受体辅助激活因子-1α(Peroxisome Proliferator-activated Receptor-gamma Co-activator-1α,PGC-1α)及MnSOD mRNA测定。提取总RNA后通过实时聚合酶链式反应法测定,操作严格依照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法 分类资料统计应用表、PXC表χ2检验,计量资料采用t检验，低数量指标采用Fisher检验，多重比较采用S-N-K检验，多个因素比较采用F检验，随后以SPSS 21.0统计软件展开分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线粒体膜电位、呼吸控制率及氧自由基 红景天苷组大鼠心肌细胞膜电位、呼吸控制率与氧自由基强度均较对照组高(P<0.05)。见表1。

表1 线粒体膜电位、呼吸控制率及氧自由基比较

2.2 细胞膜通透性 对照组细胞膜通透性低于红景天苷组，且药物剂量与细胞膜通透性呈正相关性，细胞膜通透性随药物剂量增加而升高。见图1。

2.3 MDA及SOD水平比较 红景天苷组MDA较对照组低,同时SOD较对照组高(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠心肌MDA及SOD活性比较

2.4 心肌细胞线粒体的变化情况 对照组大鼠心肌细胞显著肿胀,可见细胞膜破裂、细胞器散落存在,线粒体出现肿胀状态,且可见空泡改变,内部基质可见不均匀密度,内腔有明显的扩张。随着红景天苷剂量的增加,大鼠心肌细胞线粒体损伤减轻。见图2。

2.5 PGC-1α及MnSOD mRNA 红景天苷组PGC-1α及MnSOD mRNA均较对照组高,且红景天苷剂量越高,PGC-1α及MnSOD mRNA越高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 4组大鼠PGC-1α、MnSOD mRNA活性比较

3 讨论

越来越多的资料中阐明，热射病大鼠线粒体功能及结构会严重受损，这是其出现多器官衰竭重要因素[6-7]。另外，在高热条件下也会损害线粒体膜，由于蓄积较多氧自由基会对其产生严重损害[8]。所以，清除氧自由基是对热射病患者治疗的关键，旨在最大程度保护线粒体膜不受损害，进一步改善患者心脏功能。

红景天是一种抗疲劳、抗氧化的传统中药，目前被广泛用于抗衰老、抗缺氧、抗高原反应中，同时也被临床用于高血脂及心力衰竭等多种老年疾病预防中[9-10]。从现代医学角度讲，有效成分红景天苷用于心脑血管疾病中，心肌氧化应激反应指标得到明显改善，最大限度避免损伤心脏功能[11]。基于当代药理学分析，红景天苷会很好地保护受损线粒体，SOD活性得到提升基础上能够清除氧自由基，进一步减轻氧自由基对细胞结构的损伤程度[12]。

线粒体在不受损情况下会有氧化磷酸化产生，但若细胞膜凋亡则会降低线粒体膜电位[13]。通常情况下，若线粒体呼吸控制率下降也表示线粒体功能降低[14]。部分学者指出，产生大量氧自由基标志着脂质抗氧化及过氧化系统失衡，会增加器官功能障碍程度[15-16]。MDA为受损后氧自由基产物，SOD为清除氧自由基主要酶，因此可通过MDA、SOD指标变化情况判断机体受损程度[17-18]。PGC-1α是糖代谢的主要因子，可促进线粒体合成，对氧化蛋白进行拮抗[19]。MnSOD mRNA会拮抗氧自由基损伤过程，为线粒体主要酶[20-21]。热射病发生后,大鼠PGC-1α、MnSOD mRNA均下调,提示热射病大鼠存在PGC-1α、MnSOD mRNA功能受损。

本研究表明:红景天苷剂量越大,大鼠心肌细胞膜电位、呼吸控制率与细胞膜通透性越高、大鼠心肌氧自由基越低,MDA低表达,SOD与PGC-1αmRNA、MnSOD mRNA呈高表达，对热射病大鼠来说，红景天苷会有效降低组织受损程度，提高呼吸控制率、线粒体膜电位,同时对MDA进行抑制,提升SOD及PGC-1α、MnSOD mRNA表达,达到保护大鼠心肌的效果。

综上所述，红景天苷用于热射病大鼠干预中，有助于降低其心功能损伤程度，对心功能改善和呼吸控制率提升均具有重要意义。且剂量越高,效果越明显,其机制可能为上调PGC-1α、MnSOD mRNA表达有关。但因本研究未开展临床研究，所以之后需要扩展研究范围，为疾病治疗提供基础和依据。