下瘀血汤对肝癌细胞生物活性及Nanog信号通路表达的影响

莫国臻 黄关璇 石宇昕 吴秀芹 曹传辉

(南方医科大学珠江医院,广州,510280)

肝癌是一种发生在肝脏的恶性肿瘤,其发病率较高,致死人数较多。据相关数据统计表明,世界上每年约60万人患肝癌,在我国,患有肝癌的人数占全世界的50%之多[1-2]。早期肝癌患者无明显的症状,患者在检查时多为中晚期,因此导致肝癌晚期患者在5年内的生存率仅有5%[3-4]。对于癌症的治疗,我国目前主要以手术以及化疗为主,但化疗的耐药性较强,使得患者在的预后达不到理想目标。近年来,中药在临床上对于治疗肝癌具有一定的优势,中药中下瘀血汤最早用于妇女产后瘀血等,根据近年来的实验研究发现,下瘀血汤可抗肝纤维化、防治肝硬化[5-6]。下瘀血汤由生大黄、桃仁、土鳖虫等多为中药组成,周岱翰教授运用下瘀血汤治疗肝癌积累了丰富经验[7]。Nanog(胚胎干细胞转录因子)是一种与干细胞特性相关的转录因子,近年来研究表明,癌细胞中的干细胞样特性(为高表达干细胞相关基因特征)与肿瘤的恶性发展及预后联系密切,因此Nanog在肿瘤中的作用引起了医学界的重视[8-9]。至今,在前列腺癌等多种癌症中均发现Nanog的表达异常,在肺癌细胞体内成瘤的过程中也发现Nanog的异常表达[10-11],但对于癌细胞活性的具体作用机制目前为止尚不明确,因此本研究探讨下瘀血汤对肝癌细胞的作用及对Nanog的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取10只6～8周龄健康SD大鼠,雄性,体质量(0.12±0.02)kg,购自上海西唐生物公司(动物合格证号:粤检证字第95A08号)。常规饲养,自由饮食饮水,饲养1周后进行实验。人肝癌细胞HepG2来自广州吉妮欧公司,置于37 ℃、5%的CO2培养箱内培养4 h,待细胞完全贴壁后,更换培养液(10%胎牛血清杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle Medium，DMEM)),待细胞融合度到80%～90%时,传代,吸弃培养基,磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)冲洗3次,胰蛋白酶(0.25%)消化,完全培养基中断。将剩余贴壁细胞吹打脱落,收集细胞悬液至离心管中(15 mL)离心5 min,离心半径8 cm,1 500 r/min。去上清液,重悬,按1∶3比例接种到新的培养瓶,做好标记,继续培养。取3～5代细胞用于实验。本研究已通过南方医科大学珠江医院医学伦理委员批准(伦理审批号:2017-074)。

1.1.2 药物 下瘀血汤:生大黄(四川商宇药业公司，批号:074180801),桃仁(上海哈灵公司，批号:120953-200705),土鳖虫(广东三蓝公司，批号:Z19991101),由南方医科大学珠江医院中药制剂室煎制,浓度为每毫升含生药量0.4 g。

1.1.3 试剂与仪器 DMEM培养液(上海吉诺生物公司,货号:CM0104),胎牛血清(杭州沃丰生物公司,货号:SFBE),酶标仪(上海闪谱科技公司,型号:ReadMax 1900),流式细胞仪(赛默飞世尔科技生命科学产品，型号：Attune NxT)，胰蛋白酶(上海实维仪器技术公司,型号:9002-07-7)。

1.2 方法

1.2.1 分组与含药血清制备 将培养的人肝癌细胞HepG2采用数字随机法分为空白血清组、低剂量含药血清组、中剂量含药血清组、高剂量含药血清组。10只大鼠采用数字随机法分为正常组及下瘀血汤汤组,常规喂养,下瘀血汤组灌服(22.15 g/kg)水煎浓缩液,正常组给予同等剂量蒸馏水灌胃,2次/d,共干预1周,最后一次灌胃2 h后,正常组及下瘀血汤组大鼠均戊巴比妥麻醉(3%),心脏取血,分离血清,-20 ℃保存备用。

1.2.2 下瘀血汤干预方法 空白血清组:正常细胞在150 μL 10%大鼠空白血清培养基+13.5 mL无血清培养基;低剂量含药血清组:正常细胞在75 μL 2.5%大鼠下瘀血汤含药血清+75 μL 7.5%大鼠空白血清培养基+13.5 mL无血清培养基;中剂量含药血清组:正常细胞在75 μL 5%大鼠下瘀血汤含药血清+75 μL 5%大鼠空白血清培养基+13.5 mL无血清培养基;高剂量含药血清组:正常细胞在150 μL 10%大鼠下瘀血汤含药血清+13.5 mL无血清培养基。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 MTT检测各组肝癌细胞活性 将各组癌细胞(3×103个/孔)接种到96孔板中,贴壁后饥饿24 h,待细胞的密度培养到50%时,更换培养基,加入MTT于37.5 ℃,5%CO2下培养,4 h后离弃上清液,加入DMSO,采用酶标仪于490 nm波长下测定光密度OD值。

1.2.3.2 实时PCR检测各组Nanog的表达 用Trizol裂解各组HepG2细胞,提取RNA并逆转录,将逆转后所得的cDNA进行荧光反应实验。扩增条件为,94 ℃预变性5 min后,94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共35 cycle,72 ℃延长10 min,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，G3PDH)为内参。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.3.3 蛋白质印迹法检测Bcl-2、胱天蛋白酶-3的表达 将HepG2细胞细胞进行裂解并提取核蛋白,并对核蛋白的浓度进行测量,分装后,保存在零下20 ℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混均,按照4∶1的比例进行电泳。后将蛋白样品(50 μm)转移聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上,脱脂奶粉封闭1 h。加入1抗按1∶100稀释后孵育过夜,TTBS漂洗3次,10 min/次,最后加入2抗对溶液稀释,常温封闭。取出PVDF膜,漂洗1次/隔10 min,共3次,二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)显色后照相,后计算其蛋白表达含量。

1.2.3.4 流失细胞仪检测各组肝癌细胞的凋亡情况 收集细胞(2×105/孔)接种于6孔板中,胰蛋白酶消化,完全培养基终止;PBS清洗,进行细胞计数，1 250 r/min,离心半径8 cm,离心6 min,弃上清,混入500 μL Binding Buffer(结合缓冲液)重悬。加入5 μL Annexin V-FITC混匀、10 μL碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)混匀,室温避光孵育5～15 min,随即进行流式细胞仪检测。

1.2.3.5 Transwell法检测各组肝癌细胞的侵袭力 各组MCF-7细胞接种与6孔板中,将50 mg/L的基质胶稀释后加入小室上层,37 ℃下呈凝胶状态,细胞数目为1×105/mL，上室中加入细胞悬液,下室中加入少量胎牛血清培养基,37.5 ℃,培养2 d,取出培养基,拭去残留细胞,现配结晶紫,每孔500 μL,将小室放入,25 ℃染色30 min,PBS清洗1次,晾干。显微镜观察每个样本连续选5清晰视野进行数量统计,然后计算器平均数。

2 结果

2.1 肝癌细胞活性比较 4组肝癌细胞OD值随着时间的延长均有所增加,空白血清组与低剂量含药血清组在不同时间点的细胞活性均较为接近(P>0.05)空白血清组在24 h、48 h、72 h时OD值均高于中剂量、高剂量含药血清组,差异有统计学意义(P<0.01),低剂量含药血清组、中剂量含药血清组、高剂量含药血清组任意2组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表2 各组不同时间点肝癌细胞活性比较

2.2 肝癌细胞中Nanog mRNA的表达结果比较 空白血清组肝癌细胞中Nanog mRNA的水平高于低剂量、中剂量、高剂量含药血清组,差异有统计学意义(P<0.01),低剂量含药血清组、中剂量含药血清组、高剂量含药血清组任意2组肝癌细胞中Nanog mRNA的水平比较,差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 各组Nanog mRNA水平比较

2.3 肝癌细胞中Bcl-2、胱天蛋白酶-3蛋白表达结果比较 空白血清组肝癌细胞中Bcl-2的蛋白表达水平高于低剂量、中剂量、高剂量含药血清组(P<0.01),胱天蛋白酶-3的蛋白表达水平低于低剂量、中剂量、高剂量含药血清组(P<0.01);低剂量、中剂量、高剂量含药血清组3组肝癌细胞中Bcl-2、胱天蛋白酶-3蛋白任意2组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)。见图1、表4。

表4 各组Bcl-2、胱天蛋白酶-3水平比较

2.4 肝癌细胞凋亡率比较 空白组肝癌细胞凋亡最少，随着药物剂量的增加肝癌细胞凋亡增加，Q2与Q4相加显示肝癌细胞凋亡数量。见图2。空白血清组肝癌细胞凋亡率与低剂量含药血清组比较明显降低(P<0.01),中剂量含药血清组肝癌细胞凋亡率高于低剂量含药血清组(P<0.01),与中剂量含药血清组比较,高剂量含药血清组肝癌细胞凋亡率显著升高(P<0.01)。见表5。

表5 各组细胞凋亡率比较

2.5 肝癌细胞侵袭能力比较 空白血清组肝癌细胞的侵袭数量高于低剂量含药血清组(P<0.01),中剂量含药血清组肝癌细胞的侵袭数量低于低剂量含药血清组(P<0.01),高剂量含药血清组肝癌细胞的侵袭数量最少,显著低于其他3组(P<0.01)。见图3、表6。

表6 各组细胞凋亡率比较

3 讨论

研究发现诱发肝癌因素有多种,如病毒性肝炎、酒精性肝病等,患有乙肝、肝硬化患者肝癌发病率较高[12]。肝癌干细胞是肝癌的起始细胞,是一种具有很强的增殖分化能力的细胞,目前Nanog是肝癌干细胞的标志物,其对于干细胞的增殖分化等具有一定的调控作用[13],有关研究发现,肝癌干细胞的增殖分化越强时,Nanog的表达水平越高,但目前为止未发现有何中药物可调控其的表达,本研究探讨药物对Nanog的影响以及对肝癌细胞的作用。

下瘀血汤中大黄具有清瘀热、活血化瘀等作用,其性寒,药性沉稳;桃仁具有去除瘀血的功效,善于破除血滞[14];下瘀血汤中大黄的有效成分大黄素根据多种研究证实可阻碍多种肿瘤细胞的分化及增殖。根据相关研究表明,下瘀血汤中的桃仁可抗血栓、抗肿瘤等作用;土鳖虫可破血逐瘀消积,具有促进胃癌等癌细胞凋亡等作用。在耿燕楠[15]研究下瘀血汤对胃癌细胞的实验中表明,其可促进胃癌细胞的凋亡并抑制其生长。根据张浩等[16]研究发现,下瘀血汤通过下调核仁纺锤相关蛋白1(Nucleolar Spindle-associated Protein 1,Nusap1)的表达进而阻碍肝癌细胞的增殖,同时又促使肝癌细胞凋亡加速。本研究的结果与上述研究结果相似。

肝癌干细胞具有自我复制、多项分化及自我增殖的功能,在体外特定条件下培养可抑制其分化,Nanog可通过结合靶基因调控区,可有效地抑制其分化基因的表达[17]。Nanog在肝癌细胞中水平升高是由于Nanog具有自我分化分能力,在受到刺激后表达增高可影响癌细胞发展进程,使其分化增加,导致癌症恶化。曾金敏等[18]研究Nanog对膀胱癌作用机制中发现,Nanog被沉默后基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9的表达降低,且侵入到衬垫膜外侧的T24细胞减少,其癌细胞侵袭力降低。杨晓文等[19]对肝癌细胞的研究中提出,下调Nanog的水平,可抑制癌细胞的增殖。本研究与上述研究结果相似,因此本研究认为,下瘀血汤可能是通过下调Nanog水平减少癌细胞的活性。

Bcl-2(B细胞淋巴瘤-2)是凋亡抑制的标志物,可聚集机体内突变的物质,促使癌细胞发生发展,Bcl-2可通过P27来抑制细胞周期G1/S转换,具有抑制细胞凋亡的作用[20]。刘晓宇和张红[21]研究半边莲煎剂对肝癌的作用及对肝癌中P27及Bcl-2的影响时发现,半边莲煎剂可以抑制肝癌的发展,其作用机制可能与半边莲抑制剂减弱了Bcl-2的表达、提高了P27的表达有关。大黄是下瘀血汤中的一味中药材。孙玮[22]研究乳腺癌的研究中提出,大黄可降低Bcl-2的水平,促进癌细胞的凋亡。

胱天蛋白酶-3是由多腺苷二磷酸核糖聚合酶及APD-核糖组成细胞凋亡的执行蛋白酶,是一种凋亡信号蛋白,对于细胞凋亡凋亡有正向促进作用,当细胞凋亡时,多腺苷二磷酸核糖聚合酶的联系被切断,使锌指结构与催化区域分离,导致功能发挥异常,加剧凋亡[23]。孙媛和李青山[24]等通过沙利度胺联合叶酸、氟尿嘧啶、奥沙利铂(Folinic Acid Fluorouracil Oxaliplatin,FOLFOX)促进了肝癌细胞凋亡的研究发现,其作用机制与激活胱天蛋白酶-3信号通路有关。根据耿燕楠[15]的研究表明,下瘀血汤对于胃癌裸鼠移植瘤生长抑制作用的研究发现,下瘀血汤对胃癌裸鼠异种移植瘤的抑制率为36.5%,其机制与调控胱天蛋白酶-3、Bcl-2蛋白表达有关,这与本研究结果相似,说明下瘀血汤促进肝癌细胞凋亡可能与下调Bcl-2、提高胱天蛋白酶-3的表达有关。

综上所述,下瘀血汤通可抑制肝癌细胞的活性及其侵袭能力、促进癌细胞的凋亡,其作用机制可能调控与Nanog信号通路,从而促进胱天蛋白酶-3的表达、抑制Bcl-2水平有关。