铁皮石斛茎段原球茎的诱导增殖与分化

黄楚燕 梁宏宇

(1 广州中医药大学第一附属医院,广州,510405; 2 广东省第二中医院,广州,510405)

铁皮石斛是兰科石斛多年生草本植物,据相关文献记载,其味甘,归胃、肾经,性微寒;具有滋阴清热,益胃生津等功效。近代研究表明铁皮石斛的多糖具有抗肿瘤、增强免疫力、抗氧化以及降血糖等方面的作用。通过人工培养技术可以有效地扩大其生长产量,组培工厂化的生育苗一般需要保证配方的稳定,增殖系数比较高,种苗的质量有保障。近几年以来出现了很多铁皮石斛组织培养的企业,通过茎段原球茎的途径可以让最终生产出的种苗都来自同一颗木本,这样就可以让其后期的种苗整齐一致,而且还可以有效地提高增殖系数。

1 材料与方法

1.1 材料 野生的铁皮石斛是此次试验最重要的素材,其对于生长环境以及气候等方面的要求标准非常高,很多时候都是将其种植在温室大棚中[1]。这样可以有效控制其生长所需的湿度、温度以及透光度等条件,在此选择生长健康的,没有病虫灾害的当年嫩茎将其除叶作为试验材料[2],如图1所示。

1.2 方法

1.2.1 消毒处理 主要操作流程就是自来水冲洗-流水冲洗-滤纸吸干水分[3]。将其在超净的工作台上进行修剪,剪成每个段都包含1～2个茎节,长度约为3 cm。接下来将其放在浓度为75%的乙醇中浸泡,时间为30 s,到时间后再将其放入浓度为0.1%的升汞溶液中浸泡,时间为6 min[4]。最后就需要再冲洗1次,一般是采用无菌水,再通过无菌滤纸完成干燥处理,然后将终端的伤口进行切除处理形成带一个节的段,然后再将其接种到试验培养基。

1.2.2 试验培养基的配备 以VW(Vacin and Went)培养基、1/2MS(Murashige and Skoog)培养基和MS作为试验基础培养基来进行试验,在添加相关生长调节剂的时候需要根据不同的培养时期来配置不同比例和浓度,另外还需要考虑将香蕉和马铃薯等作为附加物添加到培养基内部。在添加的过程中要注意对马铃薯进行相关处理,先去掉外皮然后再进行称重,再将其切成小块,在使用之前还需要将其煮烂打碎成浆[5];同样对于香蕉的使用前也要进行称重剥皮,然后研磨成香蕉泥才可以使用。所有的培养基都需要调节其pH值为5.6,还需要添加琼脂7 g/L,这样保持在121 ℃的状况下保持20 min目的就是进行有效的灭菌,然后等其冷却凝固后再使用[6]。

2.3 原球茎诱导 采用正交的试验方式对N-乙酰天冬氨酸(N-acetyl-aspartate，NAA)(0.1、0.5、1.0 mg/L)、6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)(1、2、4 mg/L)以及基本培养基(MS,1/2MS,VW)对原球茎诱导率产生的影响进行研究分析,具体展开过程中,首先对所有培养基依次添加30 g/L蔗糖[7]。其次把茎段接种每个培养基上进行培养,单次接种处理数量为30瓶,1瓶对应1个茎段[8]。

2.4 原球茎增殖和分化处理 依然通过正交设计试验方式对马铃薯泥质量(质量分数5%、10%、20%)、蔗糖(不同含量10、20、30 g/L)以及基本培养基(MS,1/2MS,VW)对原球茎增殖和分化产生的具体影响进行研究分析。首先对适合原球茎增殖分化的培养基进行筛选。其次采取顶部具备叶原基、颜色为淡绿色、没有出现真叶分化的原球茎,并对其进行切割形成直径在1.0～1.5 cm的小块,切割完成后接种到不同的培养基当中,单次处理接种数量为20瓶,一瓶对应10块原球茎[9]。见图2。

2.5 生根培养 为了能够筛选出最佳适宜生根的培养基,采用正交设计的试验方式来研究马铃薯泥(质量分数5%、10%、20%)、萘乙酸(NAA)(0.1、0.5、1.0 mg/L)以及香蕉泥(质量分数5%、10%、20%)的用量,每个培养基同样需要添加蔗糖含量为20 g/L。取高度范围在1.0～1.5 cm的小苗,将其依次接种到每个生根培养基当中,单次处理接种数量为20瓶,1瓶对应12丛小苗,每丛小苗上要保证具备3～4个芽[10]。

2.6 培养试验所需条件 对于试验所需条件也应该给予严格的规定,各个培养阶段的光照时间应该满足12 h/d,培养室内部的温度也应该保持在(27±2)℃,内部光照强度也要维持在4 000～5 000 lx。

3 结果

3.1 不同植物生长调节剂、基本培养基配比对于茎段原球茎的诱导影响效果 在原球茎诱导培养的试验上接种消毒后的茎段,大约培养20 d后腋芽就开始出现逐渐膨大的迹象,30 d后就会萌发出不定芽。然后在经过2个月的培养后对生长出的不定芽进行切割,使其脱离茎段,然后将其转接到相同的培养基当中进行3个月的后续培养,并对原球茎的诱导率进行统计,其结果如表1所示。通过简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR)检验,最终发现6-BA和基本培养基为铁皮石斛茎段原球茎诱导率带来的影响更加突出,NAA各个水平间并无明显差异。而1/2MS和MS基本培养基诱导率的平均值分别可以达到17.20和28.40,二者结果相差不大,但是和VM诱导率平均值4.80比较,相差显著;另外,浓度为4 mg/L的6-BA其诱导率均值结果为25.30,和1 mg/L的诱导率存在较大差异。结合以上数据结果,可以得出:最适宜诱导铁皮石斛茎段原球茎的培养基组合是NAA 0.1 mg/L+1/2MS+6-BA 4.0 mg/L。

表1 不同植物生长调节剂、基本培养配比诱导茎段原球茎简单重复序列检验结果分析

3.2 不同基本培养基、马铃薯泥以及蔗糖浓度增殖分化原球茎效果 基本培养基对于铁皮石斛茎段原球茎的增殖率和分化率影响都有着明显的效果,其中MS的增殖率达到了11.80,效果是最好的,相比VW和1/2MS的增殖率效果差异非常明显。而分化率则是均值为5.86的1/2MS效果最佳,和MS的分化率呈现出较强的优势。蔗糖对于铁皮石斛茎段原球茎的增殖和分化效果也比较明显,马铃薯泥的影响相对来说均没有达到显著的差异,但是增加了10%的马铃薯泥后铁皮石斛茎段原球茎的分化苗变得更加粗壮。因此,可以得出的结论就是铁皮石斛茎段原球茎增殖最佳的培养基是:MS+蔗糖30 g/L;分化的最佳培养基是:马铃薯泥10%+蔗糖10 g/L+1/2MS。该正交试验结果见表2～3。

表2 不同基本培养基、马铃薯泥和蔗糖增殖分化原球茎效果分析

3.3 香蕉泥、NAA和马铃薯泥对铁皮石斛茎段原球茎生根效果的分析 试验过程中将分化后的铁皮石斛茎段原球茎接入马铃薯泥10%+蔗糖10 g/L+1/2 MS中培养大约2个月的时间,苗高在1～1.5 cm上下然后将其接到生根的培养基4个月的时间,然后统计其生根的根长、根数以及苗柱高度(图3)。根据统计，NAA对于根长以及根数的影响效果较好,对于苗柱的高度影响方面不是非常明显;马铃薯泥对于苗柱高度的影响效果显著,但是对于根长和根数的影响效果却不是很明显;香蕉泥对于根长的影响效果非常明显,但是对于根数以及苗柱高度的影响却不是很明显。综上所述,铁皮石斛茎段原球茎的生根最佳培养基组合是马铃薯泥10%+1/2 MS+NAA 1 mg/L+香蕉泥10%。见表4、表5。

表3 不同处理因子对原球茎增殖和分化的简单重复序列检验分析(%)

表4 香蕉泥、马铃薯泥和NAA对于铁皮石斛茎段原球茎生根的效果分析

表5 香蕉泥、马铃薯泥和NAA生根效果的简单重复序列检验分析

4 讨论

组织培养过程中,通过SSR检验,最终发现6-BA和基本培养基为铁皮石斛茎段原球茎诱导率带来的影响更加突出,NAA各个水平间并没有明显的差异。1/2MS和MS基本培养基诱导率的平均值分别可以达到17.20和28.40,二者结果相差不大,但是和VM诱导率平均值4.80比较,相差显著;另外,浓度为4 mg/L的6-BA其诱导率均值结果为25.30,和1 mg/L的诱导率存在较大差异。说明不同的浓度在诱导铁皮石斛茎段原球茎的培养方面产生非常大的差异,需要严格取样来诱导培养。在组织培养过程中,香蕉和马铃薯作为添加物放置到培养基中,暂时无法判断产生的物质具体情况,但是可以实现对植物生长的促进效果,与其他研究结果相似[11-13],认为马铃薯对促进苗生长有积极作用[14-15],香蕉乳对铁皮石斛的生根也带来积极影响,二者共同作用下,可以提高铁皮石斛的生长[16],有研究表明香蕉提取液可以作为培养基的缓冲剂,通过控制培养基的pH值,来进一步诱导生根[17-18]。

铁皮石斛的产地、种类,培养过程中的温度、光照强度、时间等都对诱导腋芽产生差异的效果[19-21]。本研究中通过控制培养环境,提高研究的科学性,研究中对于试验所需条件也应该给予严格的规定,各个培养阶段的光照时间应该满足12 h/d,培养室内部的温度也应该保持在(27±2)℃,内部光照强度也要维持在4 000～5 000 lx。同时,没有添加激素的情况下,有利于建立基本培养基及添加物对研究样本的实验条件。在原球茎诱导、增殖、分化过程中,植物激素的作用显而易见,一般情况下高浓度的细胞分裂素有利于诱导芽的产生,而低浓度的生长素有利于根的形成,但是不同浓度的激素对芽、根产生异常影响,不利于后续铁皮石斛的各种药物机制和增殖研究。因此,本研究探讨了不添加激素的情况下,铁皮石斛的诱导、增殖和分化研究。在铁皮石斛茎段原球茎的组织培养过程中,原球茎的分化属于至关重要的一环,其分化效果对控制组培过程化的生产投入有着十分重要的意义。根据相关研究发现,通过配合使用生长素与特定浓度的细胞分裂素,可以有效改善铁皮石斛原球茎分化效果,但是对于浓度有严格的要求,过高或者过低都不利于其分化。由于铁皮石斛的组织培养周期较长,不同阶段的培养基需要有不同的成分和条件,增殖与分化所用的培养基差异化也对铁皮石斛茎段生芽到生根产生影响,本研究结果显示,最适宜诱导铁皮石斛茎段原球茎的培养基组合是NAA 0.10 mg/L+1/2MS+6-BA 4 mg/L,铁皮石斛茎段原球茎增殖最佳的培养基是:MS+蔗糖30 g/L;分化的最佳培养基是:马铃薯泥10%+蔗糖10 g/L+1/2 MS。铁皮石斛茎段原球茎的生根最佳培养基组合是马铃薯泥10%+1/2MS+NAA 1 mg/L+香蕉泥10%,3个不同阶段的培养基要求不一样。同时在培养的过程中对于激素的使用也会引起种苗产生变异。本研究所进行的试验在没有添加激素的前提下,基于正交试验方式发现变化蔗糖含量和基本培养基能够对铁皮石斛茎段原球茎增殖和分化效果进行调节,并找出了最理想的组合模式。