不同克隆PD-L1抗体在非小细胞肺癌肿瘤组织中的表达差异性分析

李荣，雷先华，廖伟莲，王冬梅（赣州市肿瘤医院病理科，江西 赣州 341000）

在非小细胞肺癌（NSCLC）免疫治疗中，化疗药物联合抗PD-1/PD-L1抑制剂单药的治疗方案，其疗效较为满意［1-2］。免疫治疗NSCLC方案中PD-L1疗效预测标志物应用较广，因个体差异，为筛选出合适的抗体治疗方案，需对肿瘤标本施行PD-L1检测。而免疫组织化学（IHC）法是利用抗原抗体结合的原理，使被荧光色素标记的抗体与细胞或组织的特异抗原结合显色，进而确定被检测细胞或组织的免疫学特性。由于不同克隆PD-L1抗体之间的检测结果缺乏一致性的观察数据，导致在实际工作中抗体选择上的效率不高［3］。基于此，为规范PD-L1-IHC检测标准，提高工作效率，我们将2019年全年诊治的非小细胞癌的100例组织蜡块，采用4种克隆抗体进行PD-L1检测，分析抗体表达的一致性。提高病理诊断的精准性，以期为临床用药提供证据。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019年1月至2020年1月我院收治的非小细胞肺癌的肿瘤组织蜡块100例，选取符合条件的100例入组，纳入条件：（1）切片中有足够肿瘤细胞数量，不少于100个（2）细胞形态保存完好，坏死少［4］。

1.2 方法及路线抗体克隆号及生产公司：22C3（Dako公司），SP263（Roche公司），ZR3（基因科技（上海）股份有限公司），MXR003（福州迈新生物技术开发有限公司），免疫组化染色比对试验肿瘤组织蜡块切片，用免疫组化防脱玻片捞片6张，经防脱烤片、脱蜡水化等前期处理后进入PD-L1免疫组化实验，克隆号22C3、SP263等商业试剂盒采用推荐的VENTANA检测平台和检测流程，国内公司克隆号为ZR3、MXR003等抗体，在实验室同一平台自建检测方法染色［5］。

1.3 结果判读、数据分析（1）采取半定量评分方式来计算着色比例。TPS值判断标准：着色肿瘤细胞/总肿瘤细胞×100%。TPS（ZR3PD-L1≥1%、22C3-PD-L1≥25%、SP263PD-L1≥25%、MXR003≥25%）。（2）公用cut-off值的筛选：选取cut-off值≥25%、≥20%、≥15%、≥10%、≥5%、≥1%为备选值，对比找到SP263、22C3、ZR3、MXR003抗体自身cut-off值；以及抗体间一致率最高的cut-off值。（3）互换（SP263、22C3、ZR3、MXR003）4种抗体的cut-off值抗体，分别分析一致率［6］。

1.4 统计学处理数据采用SPSS 25.0统计学软件进行处理。分析SP263、22C3、ZR3、MXR003的PDL1-TPS差异度。比较SP263、22C3、ZR3、MXR0034者之间的相关性、一致性，用Kappa值表示；判读SP263、22C3、ZR3、MXR003的cut-off值，分析4种抗体两次染色结果。

2 结果

2.1 SP263、22C3、ZR3、MXR003克隆抗体PD-L1表达染色结果分析SP263、22C3、ZR3、MXR003抗体取得了不同强度的染色结果，其中ZR3、MXR003、22C3染色PD-L1阳性结果，均高于SP263染色PDL1阳性的结果。见图1。

图1 4种克隆体进行PD-L1染色结果IHC中倍放大；A：22C3肿瘤细胞膜弱阳性；B：SP263肿瘤细胞阴性；C：ZR3肿瘤细胞膜中等强度阳性；D：MXR003肿瘤细胞膜中等强度阳性

2.2 对比分析SP263、22C3、ZR3、MXR003克隆抗体一致性分析四者之间对比结果显示，ZR3/MXR003与22C3的相似度较高、相关性较好（Kappa=0.732，P＜0.01）；SP263跟ZR3/MXR003（Kappa=0.492，P＜0.01）和22C3（Kappa=0.603，P＜0.01）间相关性差异较大。见图2。

图2 抗体的检测相关性/差异性对比曲线图

2.3 SP263、ZR3、22C3、MXR003克隆抗体的公共outoff值分析PD-L1染色阳性一致率100%时，SP263、22C3、ZR3、MXR003抗体的cut-off值≥5%。因此，5%可为SP263、22C3、ZR3、MXR003的公用判读cut-off值。

2.4 互换（SP263、22C3、ZR3、MXR003）out-off值后的一致率分析使用ZR3cut-off值对ZR3（TPS≥和ZR3cut-off值判读，一致率均为90%；由于研究样本蜡块的问题，22C3与SP263（TPS≥25%）互换cut- off值无差异。见表1。

表1 4种抗体互换out-off值后的一致率

3 讨论

循证医学证据说明，不同药物下NSCLC免疫治疗的患者，其肿瘤细胞PD-L1表达也略有差异［7-10］。厂商在研发或生产抗体时，为了满足免疫精准治疗的需求，选择不同的细胞株的标准可能会考虑抗体的灵敏度、特异性、以及专利差异［11］。克隆抗体不同，其判读结果、cut-off值均有所不同，说明不同的抗体在检测同一样本时具有不同程度的差异［12］。有学者在研究中，曾分别将Roche-SP263、Dako-22C3进行染色，用50%、1%这两个cut-off值判读PD-L1表达，结果得出，判读结果差异性较大，出现39.43%（28/71）判读结果具有差异。判读结果的差异性可能会导致适合免疫疗法的一部分患者失去治疗机会［13］。本次研究收集100例2019年1月至2020年1日非小细胞肺癌的肿瘤组织蜡块。检测4种克隆抗体肿瘤细胞中PD-L1的表达，对比各自的染色结果、互换cut-off值、取公共cut-off值、判读染色结果、计算TPS，分析其相关性。研究结果显示，ZR3、22C3、MXR003的阳性结果较SP263要高。ZR3、MXR003、22C3间一致性较高（P＜0.01）；SP263与ZR3（P＜0.01）和22C3/MXR003（P＜0.01）的相关性较低，公共cutoff值为5%。22C3和ZR3、MXR003抗体间PD-L1表达在互换公共值后，其一致率高达96%。

根据本次试验，当cut-off值≥5%，SP263、22C3、ZR3、MXR003抗体总一致性为96%左右，一致性较高，但仍需更多的样本研究来支持该结论。为了使判读结果具有一定的真实性和可靠性，抗体的判读标准需通过大量的临床试验，获取更多的循证医学证据支持。为避免影响患者用药筛查，并不支持临床实际找那个使用这一数值替代原有的cut-off值［14-15］。

尽管目前已经有标准的免疫组化法在实际中应用，但仍旧在实际操作时，具有一定的局限性，导致PD-L1IHC检测的实际应用率较低［16］。因此，为增加PD-L1IHC检测的可行性，增加不同抗体PD-L1表达一致性，可以在不同平台间确定一个方标准。基于此，有学者进行一项研究，得出以下结论，对500例标本行SP263、22C3、28-8染色后，观察三者的染色模式类似；各抗体PD-L1染色一致性较高。通过对比上述不同抗体蜡块PD-L1的表达结果，研究说明每一种抗体检测肿瘤细胞的PD-L1都能取得理想的效果。由于样本量以及组织蜡块的限制，试验结果真实性和可靠性还有一定的欠缺，未来仍需更多的数据支持。

综上所述，科室利用全自动免疫组化染色平台，各克隆号抗体免疫组化染色结果与免疫抑制剂疗效相关性获得临床认同。在规范检测平台、检测流程等条件情况下，ZR3与MXR003的PD-L1一抗试剂，在切片上显色定位准确（在细胞膜上）、信号清晰、对比度良好，与克隆号22C3抗体有较高的一致性，基因公司克隆号ZR3和福州迈新公司克隆号MXR003的PD-L1抗体，其检测结果在一定程度上与Dako公司22C3的PD-L1抗体可替代互用。