α-1抗胰蛋白酶缺乏症相关肝病的诊治研究进展

杨子新 王胜兰

AAT是一种蛋白酶抑制剂，主要在肝细胞中表达，然后通过内质网分泌到血液中，以保护肺免受中性粒细胞蛋白水解酶的降解，由位于14号染色体长臂上的 SERPINA1基因编码，Pi*M是正常的等位基因，但据报道，该位点上已经发生了超过150个突变，最常见的是Pi*Z型和Pi*S型[1]。Z型突变是342位谷氨酸被赖氨酸取代，S型突变是264位的谷氨酸被缬氨酸取代，还有一些罕见病变，如Mmalton型等。Z型产生的AAT是正常水平的10%～20%，S型产生的AAT是正常水平的60%～80%[2]。ZZ纯合子是临床上导致AATD最常见的基因型，约96%的相关疾病与此相关，血清AAT水平极低，仅达正常的10%～15%，另外少部分是SS、SZ、MZ等，血清AAT水平仅为正常值的35%～70%[3]。由于SERPINA1基因突变导致肝细胞内生成的AAT异常聚集，异常聚集的AAT多聚体(Z-ATT)不能通过内质网分泌到循环血液中，滞留在肝细胞内，造成蛋白毒性肝损伤，引起成人及儿童肝病。

一、遗传流行病学特性

典型的重症AATD多由Pi*Z纯合子变异引起，在欧洲人中的比例大约是1：2000，其特点是血清AAT浓度显著降低(低85%左右)，蛋白酶与蛋白酶抑制剂之间严重失衡；杂合型Pi*MZ可在1/30高加索人中发现，AAT血清浓度基本正常或者轻微降低；复合杂合型Pi*SZ是由反式Pi*Z和Pi*S变异体同时存在所致，它在高加索人中占到的比例大约为1/500，表现出中等的AAT血清浓度；Pi*SS基因型(即纯合子Pi*S等位基因)与Pi*SZ大致相同，但似乎不构成发生肝病的临床相关危险因素[4]。

二、AATD相关肝病的发病机制

严重的AATD病例多由Pi*Z纯合子引起，Z-AAT蛋白在内质网积聚引起相关肝病，但是其发病机制目前尚不完全清楚。

(一)Z-AAT引起内质网应激导致肝细胞损伤 Z-AAT通过改变各种细胞器的关键功能在AATD相关肝病的发病机制中发挥关键作用，如内质网、溶酶体、蛋白酶体降解系统和线粒体等[5]。线粒体，细胞内的双膜结构，是发生呼吸和能量产生的高度动态的细胞器。由于肝脏在碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢动态平衡中的中心作用，肝细胞含有高密度的线粒体。Z-AAT引起内质网应激，然而内质网应激又与脂滴的形成有关。在许多蛋白质错误折叠疾病中，脂滴的积累被观察到是内质网应激的普遍下游效应[6]。脂滴是一种细胞器，作为动物细胞中脂类的储存室，也与线粒体相关。值得注意的是，脂滴已被证明通过确保最大限度的氧化代谢和动态平衡来调节线粒体的动态。线粒体在脂滴表面蛋白Perilipin 5 (Plin5) 的介导下重新聚集到脂滴表面，改变线粒体的生物性能[7]。脂滴作为与内质网相关的细胞器，通过重新平衡内质网脂类平衡，去除错误折叠的蛋白质，调节自噬，对内质网稳态的破坏做出反应，起到保护内质网应激的作用，因此内质网应激增强了脂滴的形成和积累，脂滴产生适应性反应大量招募其周围的线粒体，负责为需要ATP的脂质合成和循环过程提供ATP，线粒体耗氧量和ATP产生增加，导致线粒体氧化和还原压力增大，从而导致肝细胞损伤甚至死亡[8]。

(二)Z-AAT使肝脏中的线粒体发生自噬 既往在Pi*Z小鼠模型的肝脏中自噬被结构性地激活[9]。自噬是一种细胞内蛋白分解途径，在应激、发育和营养缺乏的时候，特殊的空泡从内质网膜上产生并吞噬降解的靶标，可能构成一种通过降解突变体Z-AAT来保护肝细胞的机制[10]。肝细胞内自噬活性的显著增加可能会导致自噬小体中的各种亚细胞结降解。早期自噬液泡中线粒体的超微结构特征表现为在同一细胞的其他区域和在其他细胞中，线粒体完全被包裹在周边的内质网膜内，有时具有完整的、正常的脊和正常的电子密度；有时线粒体随着电子密度的增加而被压缩，被两个或多个光滑的膜包围。晚期自噬液泡的特征表现为一些线粒体位于多层膜内，整个液泡经常或者实际上与溶酶体融合，线粒体几乎完全转化为电子致密碎片[11]。LAMP1蛋白也是已知的标记晚期自噬小体。Jeffrey等[9]用溶酶体膜蛋白LAMP1的抗体免疫标记检测了Pi*Z肝脏样本。含有许多线粒体和丰富的内质网，有容易识别的空泡，其中包含线粒体结构，可辨认出脊状突起，空泡被LAMP1标记为阳性。在正常肝标本中，线粒体周围的LAMP1阳性结构很难被发现。综上所述表明，线粒体自噬在Pi*Z肝脏中是一个频繁和持续的过程[11]。

(三)Z-AAT激活JNK途径上调SERPINA1的转录，加剧Z-AAT的积聚 c-Jun是JNK通过磷酸化激活的主要细胞底物之一，通过Pi*Z小鼠肝脏中磷酸化c-Jun水平的增加,证实了c-JUN的激活[12]。c-Jun通过结合和反式激活SERPINA1的AP-1位点，上调SERPINA1的表达。与对照组相比，Pi*ZZ患者的肝脏表现出更强的JNK活性，表明Z-AAT激活JNK途径上调SERPINA1的转录，加剧Z-AAT的积聚，损害肝细胞[13]。

(四)Z-AAT及乙型肝炎表面抗原双重蛋白毒性应激 HBV S基因(HBs)产生三种表面(包膜)蛋白，即小表面蛋白(S)、中间表面蛋白(前S2和S)和大表面蛋白(前S1、前S2和S)。由乙型肝炎表面基因突变引起的大表面蛋白的过度形成限制在内质网中的膜状颗粒的形成，导致其在内质网中积累，形成毛玻璃样肝细胞。尽管Z-AAT和HBs表现出不同的溶解性质和不同的分布模式，但HBs-PIZ动物均表现出Z-AAT/HBs在降解途径中的保留和自噬适配器p62的显著积累[14]。同时对含有p62的颗粒的分离显示保留了HBs/Z-AAT。P62的积聚又导致p62-Nrf2轴的激活和活性氧物种的出现。所以当两种主要的蛋白毒性应激同时存在时，通过蛋白滞留和p62-Nrf2轴的激活促进了肝损伤的发展[15]。

(五) NSAIDs药物的作用 AATD的动物模型研究表明，NSAIDs药物可导致Pi*Z小鼠肝脏损伤加重，表现为肝细胞增殖增加和caspase 9活性增强[16]。NSAIDs药物又可激活Pi*Z小鼠体内IL-6-STAT3细胞因子信号通路。前列腺素可负向调节TNF-IL-6-STAT3信号通路，而NSAIDs抑制前列腺素合成，故可增强该信号通路，由于该信号通路可诱导肝脏中包括AAT在内的急性期时相反应物的表达，增加AAT的合成，从而增加错误折叠的蛋白质积累，进一步加重肝损伤[16-17]。

三、AATD肝病的临床表现

(一)AATD中的成人肝病 AATD在成人中的发病年龄主要在50岁左右，带Z和M(malton)等位基因的成人可能出现慢性肝炎、肝硬化或肝细胞癌，携带Pi*ZZ基因的成人中约40%存在有组织学意义的肝损伤和肝硬化[18]。目前认为，男性、年龄>50岁，代谢综合征和肥胖是重度AATD成人患者进展为晚期肝脏疾病的危险因素。ATTD和饮酒的相关性尚不清楚，但酒精滥用似乎会加速AATD相关肝纤维化的进展[16]。

(二)AATD中的儿童肝病 AATD会导致儿童肝脏损伤，最常见的表现是新生儿肝炎综合征，包括胆汁淤积性黄疸、喂养困难、肝脾大、生长困难、胃肠道出血等。然而多项研究表明，大多数Pi*ZZ儿童是健康的，在儿童时期并没有被诊断出来；少数Pi*ZZ儿童发展为胆汁淤积性肝炎(新生儿肝炎综合征)，主要表现为血清结合胆红素、丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶升高；大多数患有胆汁淤积性肝炎的新生儿可自发改善,但是仍有一部分Pi*ZZ新生儿表现出严重肝病并发症，如肝硬化、门静脉高压和肝功能衰竭[17]。

四、AATD的诊断

迄今为止，临床医生对AATD的认识远远不够，诊断可能延迟5～10年。研究表明，80%～90%的AATD患者由于缺乏临床症状，或被误诊为酒精性肝病或非酒精性脂肪性肝病等其他肝硬化病因[19]。对于有肝脏疾病家族史、不明原因慢性肝病病史或临床表现等患者应该行AATD检测。

(一)血清AAT水平的测定 血清AAT水平可通过比浊法测定，有时也可使用乳胶增强免疫比浊法；目前已不再推荐使用放射免疫扩散法和火箭免疫电泳法。人群研究表明，血清AAT的最低阈值为11μmol/L(约57 mg/dL)，低于该值则AAT含量不足。但AAT是急性期反应物，发生炎症时，真实的血清AAT水平可能会被高估，因此应该避免在患者炎症期间测定血清AAT水平[20]。

(二)等电聚焦技术 对定量检测AAT水平异常的患者，可进行表型检测,根据各种突变，根据各种突变蛋白的等电点不同,用等电聚焦法检测。根据各种突变蛋白在pH梯度下的电泳迁移率不同，将它们分成不同的类型:F、S、M、Z[21]。此外，当患者体内AAT含量比较低以及无效突变血中没有AAT时，其表型可能不能被测定出来 尚需进一步借助基因测序。

(三)基因测序 AAT的基因分型通常从全血或干血斑中提取出DNA，采用PCR进行基因扩增，然后对反应产物进行自动测序。等位基因特异性基因分型试验用于检测更普遍的Pi*S和Pi*Z，以及罕见的变异Pi*Malton。当等位基因特异性基因分型分析不能提供AAT等位基因的完整鉴定时，需对SERPINA1编码区进行直接测序[22]。

(四)肝活检 肝活检是评估肝脏损伤和纤维化程度非常有用的工具。对于AATD相关肝病患者，肝活检可能不是必需的检查手段，但仍是明确诊断的金标准。

五、AATD相关肝病的治疗

目前尚无针对AATD相关肝病的治疗药物，肝移植是解决晚期肝硬化的唯一途径。随着对AATD肝病的认识不断加深，多种针对性的治疗方案成为研究的热点。

(一)一般治疗 目前针对AATD引起的肝病无特异性方法，进行性肝损伤的治疗主要以支持为主，包括注意营养，预防软骨病，以及凝血障碍的早期识别和治疗。临床医生应治疗门静脉高压并处理并发症，如门脉高压性胃病、食管胃底静脉曲张出血和腹水等。

(二)肝移植 对于终末期肝病患者，肝移植是唯一有效的治疗手段。在成人患者中，肝脏病变通常发展到明显的肝硬化或者肝细胞癌时才被发现，肝移植可以获得较好的治疗效果；在儿童患者中，一部分出现长期黄疸，但是未见进一步的并发症，一部分出现明显肝硬化需要进行肝移植治疗。AATD肝病患者肝脏可能很快发生失代偿，因此应该早期对AATD高危患者行肝功能的全面评估，已期尽早干预，获得较好的治疗效果[23]。

(三)未来治疗新方向 针对AATD的现行治疗方法多为静脉注射纯化人血浆来源的AAT，但肝脏疾病是由错误折叠的Z-AAT在胞内异常堆积所致，因此AATD相关肝病无明显疗效，只有抑制缺陷型Z-AAT的表达才能缓解或治疗AATD相关肝病。其他的新方案包括：

1.小干扰RNA：小干扰RNA(siRNA)是一个长20～25个核苷酸的双股RNA，主要参与RNA干扰现象。siRNA与N-乙酰半乳糖胺残基偶联，通过去唾液酸糖蛋白受体介导肝细胞特异性摄取[4]。siRNA片段加载到RNA诱导的沉默复合体中，靶向mRNA被细胞内的核酸酶降解，引发靶向mRNA降解，抑制突变蛋白的产生，使血清和肝脏Z-AAT水平显著降低，从而减轻蛋白肝毒性[24]。

2.化学伴侣：化学伴侣是一类协助新生肽链正确折叠的蛋白质，可以稳定天然AAT，并改善蛋白质的错误折叠，如4-苯基丁酸及氧化三甲胺等。但既往人体试验表明，人体安全水平的化学伴侣达不到小鼠模型中的药物浓度，肝细胞内质网中的化学伴侣药物浓度不足，因此无法有效地发挥作用[25]。

3.自噬增强剂：其可诱导自噬，促进异常蛋白质的降解。Z-AAT可以激活NF-κB信号通路，参与自噬，增强剂如卡马西平、西罗莫司、胆汁酸和熊去氧胆酸能加强该通路，但这些药物尚处于临床试验阶段[26]。

4.合成肽：其具有防止Z-AAT在肝细胞内积聚的潜力。与AAT反应环P7-2序列相对应的6肽被证明完全抑制Z-AAT的聚合，而对正常形式的AAT没有任何抑制作用[27]。 因此，该分子具有防止Z-AAT在肝细胞内积聚的潜力，从而治疗AAT相关肝病。

5.单克隆抗体：可以防止Z-AAT在细胞内聚合，增加肝脏分泌正常的AAT。目前已经开发了单抗检测AAT的突变构象，如体内的scFv4B12是4B12单抗的单链可变片段，可以防止Pi*ZZ小鼠细胞内异常AAT的聚合，并增加其肝脏分泌，同时保留中性粒细胞弹性蛋白酶抑制功能，但是这种结果仅在体外证实过[28]。

6.基因修复技术：基因修复技术如CRISPR-Cas9正在改变许多医学研究领域，如人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒感染，以及单基因疾病等[25]。Bjursell等[29]证实，Pi*ZZ小鼠通过CRISPR成功地进行基因编辑后，可以减少突变的Z蛋白聚集以及增加正常AAT的适度表达。

综上，对于没有任何明确病因的慢性肝病患者，应进AATD检测。目前还没有针对AATD相关肝病的特异性药物治疗方案，因此迫切需要探索和研发有效的药物，以减少肝移植的需要和减缓疾病的进展。基因治疗和siRNA等新技术为治疗AATD所致肝病带来了希望，但目前多处于探索阶段，仍需要进一步的研究。