慢性乙型肝炎治愈临床研究进展

2022-11-19文夏杰鲁凤民贾继东

肝脏 2022年9期

文夏杰鲁凤民贾继东

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染仍是威胁公共健康的重要问题。统计数据显示，全球HBV慢性感染者约2.57亿，每年约80万人死于HBV感染相关疾病[1]。目前临床治疗慢性乙型肝炎(CHB)的药物主要包括核苷(酸)类似物(NAs)及干扰素类。前者的主要作用机制是通过竞争性与HBV DNA聚合酶结合，不可逆地终止其新链合成，从而抑制HBV的复制[1]。而后者的抗病毒机制既与直接影响HBV核衣壳的组装及HBV RNA的转录有关，也与激活细胞免疫有关。尽管这两类药物可有效抑制病毒复制，但均难以有效清除HBsAg从而实现临床治愈。

HBV在复制过程可形成稳定的共价闭合环状DNA(cccDNA)，和双链线性DNA(dslDNA)。cccDNA结构类似人类染色体，当其处于转录静默状态时，难以被人类免疫系统识别，从而帮助感染细胞清除逃避。而dslDNA可以在感染早期以非同源重组的方式整合入人类基因组，并持续表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)及C端截短型HBx蛋白，从而导致患者血清HBsAg难以被清除[3]。目前多种针对HBV 的新药及用于评价抗病毒疗效的新指标正在研发及临床试验中，在不久的将来有望实现抗病毒药物的安全停药，甚至CHB的临床治愈。

一、 HBV新型生物标志物

NAs可通过抑制前基因组RNA(pgRNA)逆转录从而使血清HBV DNA迅速下降，因此血清HBV DNA是评价抗病毒效果的重要指标。但是，仅测定血清HBV DNA不能反映肝细胞核内的cccDNA及整合在人体基因组中的HBV DNA水平及复制活性。临床上亟需反映cccDNA水平、转录活性及预测HBsAg清除的HBV新型生物标志物。

(一)HBV RNA 血清中的HBV RNA主要转录自肝内cccDNA， pgRNA存在于具有外包膜的病毒颗粒或裸核衣壳中。由于cccDNA是3.5 kb 长pgRNA的唯一来源，故后者的水平可在一定程度上反映肝细胞内cccDNA的水平。有研究显示，在未经抗病毒治疗的e抗原(HBeAg)阳性人群中，血清HBV RNA与肝内cccDNA的相关性系数约为0.781，优于血清HBcrAg、HBV DNA及HBsAg；经过48周长效干扰素治疗后发生血清学转换患者血清HBV RNA下降幅度更大[4]。但也有研究显示，在未经抗病毒治疗的HBeAg阳性CHB患者中，血清HBV RNA水平与cccDNA的相关性(r=0.25,P=0.02)反而低于血清HBV DNA(r=0.36,P<0.01)[5]。在接受NAs治疗的人群中，HBV RNA与肝内cccDNA绝对水平未见明显相关性，但与HBV RNA和cccDNA比值呈正相关(r=0.584，P=0.001)，提示血清HBV RNA与肝内cccDNA的转录活性相关[6]。

在接受恩替卡韦治疗的患者中，停药时血清HBV RNA>44.6 U/mL者的病毒学复发风险明显高于血清HBV RNA阴性且HBsAg<10 IU/mL者(93.2% vs 9.1%)[7]。在接受PEG-INF-α治疗的患者中，第12周时血清HBV RNA水平较低者实现HBsAg阴转的比例更高[8]。以上研究提示，血清HBV RNA单用或与其他指标联合应用，能够用于识别出可以安全停药、甚至临床治愈的人群。但是，目前尚缺乏经国际认证的HBV RNA标准品，而且对于定量引物的设计也存在差异，因此难以评价不同血清HBV RNA检测方法的灵敏度、准确度及可比性[9]。

(二)乙型肝炎核心抗原相关抗原(HBcrAg) HBcrAg主要包含3种病毒蛋白：HBcAg、HBeAg和22 kD的前核心蛋白，三者间有着共同的149个氨基酸序列，并均源于前核心/核心基因(pre C/C)的转录、翻译及近似的转录后修饰[10]。有研究显示，在未经抗病毒治疗的CHB患者中，血清HBcrAg水平与肝内cccDNA有显著相关性(r=0.70，P<0.001)。由于NAs治疗对病毒蛋白的产生无直接影响，因此血清HBcrAg水平仍可反映肝内cccDNA的转录活性。在NAs治疗1年后HBV DNA转阴的人群中，仍有78%的患者HBcrAg阳性，此时血清HBcrAg水平与肝内cccDNA水平的相关性系数为0.42(P<0.001)[11]。一项对34例停止拉米夫定治疗的患者的研究显示，停药后出现HBV再激活者停药时的HBcrAg水平高于无再激活者(4.9 vs 3.2 log10IU/mL，P=0.009)，HBcrAg预测HBV再激活的受试者工作曲线下面积为0.764[12]。但与HBV RNA类似，目前临床缺乏灵敏度高、结果可比的血清HBcrAg检测试剂盒。

(三)大/中/小HBsAg (L-HBsAg/M-HBsAg/S-HBsAg) HBV可表达3种HBsAg，其中大表面抗原蛋白(L-HBsAg)来源于2.4 kb mRNA，包括preS1、preS2及S蛋白；M-HBsAg/S-HBsAg 均来源于2.1 kb的mRNA，其中M-HBsAg包括preS2及S蛋白，而S-HBsAg仅包含S蛋白。L-HBsAg主要分布于Dane颗粒，其preS1是Dane 颗粒结合钠-牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)并在其介导下进入肝细胞的重要结合位点。NAs治疗后HBsAg阴转的人群往往会有M-HBsAg/L-HBsAg比例的快速下降， M-HBsAg阴转时间比总HBsAg转阴提前约12.8 个月，提示L-HBsAg及M-HBsAg比例的变化可作为预测总体HBsAg清除的指标[13]。目前有关L-HBsAg/M-HBsAg/S-HBsAg比例变化作为生物标志物的相关研究仍然有限，其临床意义仍需进一步发掘与验证[14]。

二、抗HBV药物的作用靶点及研究进展

丙型肝炎治疗的直接抗病毒药物的成功，激发了学术界和制药企业对CHB治愈方法的探索热情。目前CHB治疗的新药主要包括针对HBV感染及复制的环节的直接抗病毒药物及调节机体抗病毒应答的免疫调节剂。

(一)直接抗病毒治疗药物

1.进入抑制剂：病毒与肝细胞表面的受体结合并进入其内是HBV感染的第一步。具体机制是，L-HBsAg中的preS1区与人肝细胞膜上的牛磺胆酸钠协同转运多肽 (NTCP) 结合[15]。进入抑制剂的作用方式主要分为4类:(1) 针对preS1区域的抗体，能够识别并中和循环中的含有外包膜的完整病毒颗粒；(2) 结合肝细胞表面非特异HBV受体硫酸肝素糖蛋白的带电荷药物；(3)与肝细胞膜特异性HBV受体NTCP竞争性结合的底物，抑制preS1与NTCP的结合；(4) 不可逆性。

2.NTCP抑制剂：临床研究显示，接受不可逆性NTCP抑制剂bulevirtide (过去称Myrcludex B)联合PEG-IFN干扰素治疗的HBV-HDV合并感染者中，有34%的患者血清HDV RNA低于检测下限，优于单用PEG-IFN治疗组，目前bulevirtide 作为丁型肝炎治疗药物已经在欧盟上市[16]。但是，本药用于治疗CHB的研究仍处于Ⅱb期。其他的进入抑制剂，如单克隆抗体HH-003及HH-006分别处于Ⅱ期及Ⅰ期，hzVSF(IgG4)处于Ⅱ期，A232处于临床前期。

3.转录后抑制：靶向HBV mRNA的药物可以直接抑制病毒蛋白的产生，从而抑制其复制和感染性病毒颗粒及亚病毒颗粒的释放。此类药物主要包括小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)和反义寡核苷酸(ASO)。

siRNA与转录产物的短RNA片段结合，诱导HBV mRNA发生降解从而导致病毒基因沉默。在3.2 kb的HBV基因组中多种蛋白编码序列相互重叠，针对不同区域设计siRNA对病毒蛋白的抑制效果也有所不同。如HBV所有的5个转录本均包含有“HBx”蛋白区域的核酸序列，因此针对这个区域的siRNA可靶向所有病毒转录本[17]。虽然siRNA能够高效沉默病毒基因，但需要静脉内给药、具有脱靶风险、载体毒性不明，且有模式识别受体激活免疫的风险。为了进一步降低可能的脱靶效应，将siRNA与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)偶联进而被肝细胞特异性摄取。JNJ-3989为胆固醇GalNAc偶联的能够靶向肝细胞的针对“HBx”区域siRNA类药物，临床试验结果显示，通过与 TDF 或 ETV联合治疗，在30%的患者 HBsAg 降低大于2 log10IU/mL，并且 HBV RNA、HBeAg 和 HBcrAg也出现持续降低趋势。

ASO 与 HBV mRNA 的互补序列结合并形成杂交，可使靶标 RNA通过宿主RNase-H 依赖性途径被降解。GSK3228836 是目前正在进行Ⅱb期临床试验的ASO类药物，前期小样本研究显示，接受GSK3228836治疗的初治和经治CHB患者 HBsAg 水平能够降低约3 log10IU/mL[18]。现有研究显示，血清HBsAg定量≤100 IU/mL的NAs经治患者停药后的复发风险显著下降且停药后发生HBsAg自发阴转的几率显著增加[19]。有一些基于RNA干扰的抗HBV新药临床试验观察到部分患者的血清HBsAg水平显著下降等积极效果，但其临床意义仍有待进一步的观察研究。

4.核衣壳抑制剂： HBV病毒核衣壳包含有病毒核心蛋白，后者参与病毒生命周期的多个过程，包括病毒入胞后向细胞核转运及释放rcDNA、调节cccDNA稳定性、形成核衣壳为逆转录合成子代病毒负链DNA提供密闭场所及完成子代病毒颗粒组装。目前正在开发的核心蛋白组装抑制剂主要包括苯丙烯酰胺类和杂芳基二氢嘧啶衍生物。其作用机制为通过加强蛋白质相互作用，抑制pgRNA被组装进衣壳，同时阻断了rcDNA的生成。目前已有多种核衣壳抑制剂进入了早期临床试验阶段。其中莫非塞定(GLS4)是正在进行Ⅲa期临床试验的核衣壳抑制剂。在2020年欧洲肝病年会上公布的部分Ⅱb期研究数据对77例接受12周以上治疗患者资料进行统计，结果显示与基线相比，在接受GLS4联合ETV组与单纯ETV组患者中，HBV DNA分别平均下降5.02 log10IU/ mL及3.84 log10IU/ mL，pgRNA分别下降2.63 log10IU/ mL和0.27 log10IU/mL，其中联合用药组有28.6%的患者出现HBsAg下降≥0.5 log10IU/ mL。

5.HBsAg释放抑制剂： HBsAg可嵌入脂质双分子层构成的感染性病毒颗粒的外包膜，在病毒生命周期中发挥重要作用。HBsAg还可以通过内质网、高尔基或多囊泡小体以亚病毒颗粒大量释放到肝细胞外，从而造成抑制性免疫环境[20]。目前研发中的HBsAg释放抑制剂主要包括基于DNA的核酸聚合物(NAP)或基于RNA的NAP，其作用机制是通过与宿主因素相互作用，从而阻断亚HBV颗粒的组装和分泌。目前小型临床试验表明，NAP类药物REP-2139、REP-2165及REP-2055可以降低HBsAg向胞外释放。有关REP-2139 或 REP-2165与TDF和PEG-ING-α联合用药的Ⅱ期临床试验结果显示，在完成TDF+PEG-INF-α+NAP方案后，60% (24/40) 的 HBeAg阴性CHB患者可达到HBsAg≤0.05 IU/mL，在48周时有13例患者实现了 HBsAg 血清学转换[21]。目前本药的临床试验结果良好，但是否可以通过与其他抗病毒药物联合应用，以实现CHB临床治愈仍然需要进一步临床研究。

(二)基于免疫调节抗病毒药物天然免疫及获得性免疫对于控制HBV感染及清除HBsAg至关重要。CHB患者循环中及肝脏微环境中高水平的HBeAg及HBsAg，能够抑制HBV 特异性细胞毒性T细胞功能，导致肝脏免疫微环境通常处于抑制状态[20]，这可能是HBV感染慢性化的重要机制。因此，恢复受损的HBV特异性免疫应答是实现临床治愈CHB的重要途径。

(三)天然免疫系统激活剂 TLR7和TLR8是由多种免疫细胞(B细胞、单核细胞/巨噬细胞和树突细胞、NK 细胞和细胞毒性 T 细胞)表达的单链 RNA 分子识别受体，视黄醇(维甲酸)诱导基因蛋白I(RIG-I)是识别双链 RNA 的传感器。TLR与RIG-I的激活能够诱导 IFN 和其他细胞因子的产生，进而发挥抗病毒作用。目前正在研发中的TLR激动剂包括GS-9620、GS-9688、RG-7854、RO-7020531等。其中GS-9620及GS-9688在HBV感染黑猩猩模型中显示出良好的抗病毒作用；但前者在人类中未发现明显抗病毒治疗效果，后者对HBeAg阳性CHB患者安全性评价中亦未观察到明显的 HBsAg 或 HBV DNA 下降，是否与用药时间较短、样本量较少有关尚不清楚。目前GS-9688仍在Ⅱ期临床试验中，其治疗效果尚待更多的数据验证[22]。

三、治疗性疫苗

与预防性乙型肝炎疫苗作用不同，治疗性疫苗主要是通过修复T细胞功能，激发新的免疫应答，进而持续抑制HBV复制，从而达到HBsAg清除的效果。目前治疗性乙型肝炎疫苗主要包括：(1)蛋白疫苗，主要包括针对PreS1、PreS2、S蛋白、HBcAg蛋白等多蛋白或其抗原表位的疫苗；(2)核酸疫苗，通过病毒载体将HBV基因序列导入肝细胞进而达相关病毒抗原，激活CD8及CD4 T细胞从而发挥抗病毒效应。

GS-4774是来自可表达 HBsAg、HBcAg和HBx 抗原成分的治疗性乙型肝炎疫苗[23]，可以在健康志愿者中诱导HBV特异性T细胞应答。但是在经NAs治疗达到病毒抑制的以及未经NAs治疗CHB患者中，没有观察到HBsAg下降和消失[24]。核酸疫苗能够在动物体内产生针对HBV的抗体，但核酸疫苗携带的病毒核酸是否会与人类基因组发生整合，从而导致整合位点相关基因功能的改变，仍然是需要关注的问题。目前对治疗性疫苗的注册临床试验较多、进展较快的CVI-HBV-002也仅处于Ⅱb期，具体研究结果尚待公布。