GSK-3β在HBV相关肝细胞癌中的作用

张丹眉 石春霞 龚作炯

肝癌是世界第六大肿瘤，同时在癌症死亡率中排名第四。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是肝癌中最常见的类型，占所有肝癌病例的75%～85%[1]。病毒感染、酗酒以及含有黄曲霉食物的摄入等各种因素都会引起肝细胞癌的发生，其中最主要的因素是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus HBV)感染。尽管HBV疫苗在全球广泛接种，但乙型肝炎的发生率仍居高位[2]。肝细胞癌的治疗方式多样，但复发率、耐药性以及治疗效果并不佳。主要作用于某种重要的信号通路中某种或多个分子的治疗方法，如靶向PD-1、PD-L1的免疫治疗，在大多数疾病中都有着良好的治疗前景。因此，了解肝脏疾病发生发展的信号通路，对开发新的治疗方法、提高现有治疗方法的疗效都有着重要的意义。

糖原合成酶激酶-3(glycogen kinase synthase-3, GSK-3)是一种在哺乳动物组织细胞中广泛分布的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有多种功能。GSK-3首次报道是磷酸化糖原合酶，参与糖原合成过程；随后陆续发现多种GSK-3的底物，磷酸化其丝氨酸和苏氨酸残基[3]。除此之外，GSK-3还参与多条信号通路，调节细胞生长、分化、死亡以及蛋白质合成等多种生理过程[4]。正因为其多样的生理功能交织于细胞信号网络中，GSK-3有望成为包括肝脏疾病在内的许多疾病的重要靶向分子。

一、GSK-3结构和功能

GSK-3一般有两种亚型，即α亚型和β亚型，分别由两种不同基因编码。这两个蛋白的同源性达84%，激酶结构域高达98%的同源性，而在N-端和C-端具有差异性[5]。尽管它们具有相似的结构和一些交叉功能，但他们在机体中仍发挥各自的作用且功能上并不冗余。有研究显示，GSK-3α基因敲除小鼠可以存活，GSK-3β基因敲除小鼠则会在胚胎时期死亡，因此并没有另一个同源物质可以替代GSK-3β[6]。

GSK-3β在细胞中普遍表达，细胞静息时便具有活性，在接受外界刺激后常成抑制状态。磷酸化GSK-3β丝/苏氨酸残基调节其活性。据研究，包括生长因子、激素以及其他细胞外的刺激等分子通过磷酸化GSK-3β的9位丝氨酸(Ser9)而抑制其活性，最常见的便是蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/AKT)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)。GSK-3β被磷酸化的丝氨酸由丝/苏氨酸蛋白磷酸酶-1(protein phosphatase 1,PP1)和PP2A等去磷酸化后被激活；同样被p38 MAPK磷酸化390位(Thr390)苏氨酸后也会抑制其活性。相反，若是磷酸化GSK-3β 216位苏氨酸(Ser216)后则会激活它的功能[7-9]。

GSK-3β包含底物磷酸化位点以及底物结合位点，拥有超过100种底物，其中包括结构蛋白、转录因子、信使分子、离子转运体、细胞周期蛋白和控制凋亡反应的蛋白等[7]。此外，GSK-3β身处信号传导网络中，其中最重要的是胰岛素通路和Wnt通路，参与调节多种生理、病理过程，在糖原合成、细胞增殖、自噬、炎症反应、肿瘤发生等过程中发挥重要作用[10]。

二、HBV感染后作用于GSK-3β的上游通路

HBV的基因组独特，由不完全的环状双链DNA组成，包括4个开放读码框，分别编码表面抗原S抗原、核心抗原、具有反转录活性的DNA聚合酶和RNA酶以及X蛋白。X蛋白，也即HBx，长度大约16 000，具有反式激活作用，可以激活HBV本身或者细胞的多种调控基因，促进HBV或者其他病毒的复制[11]；HBx在HBV感染后进展为肝细胞癌的过程中起关键作用。人类、土拔鼠和沙鼠的肝病毒科成员都与肝癌有关，大多数肝癌中整合的HBV DNA含有全部或部分HBx基因[12]。

(一)PI3K/AKT 磷酸酰肌醇3-激酶(phosphatidyli-nositol-3-kinase,PI3K)/AKT通路是调节细胞生命活动的基本信号通路，由生长因子等刺激激活，可以抑制细胞凋亡。PI3K/AKT通路在多种癌症中被上调，许多病毒编码可以激活该通路的蛋白质。在HBV感染细胞中，表达的HBx蛋白可以刺激体外培养的人或大鼠原代肝细胞中的PI3K/AKT通路，并抑制HBV复制以及细胞凋亡[13]。HBx也可以通过激活PI3K/AKT通路而上调甲胎蛋白(alpha fetoprotein , AFP)表达，从而促进肝癌干细胞形成[14]。由此HBV感染后HCC形成过程中上调的PI3K/AKT通路通过某项机制发挥作用。GSK-3β作为AKT的下游靶标之一，HBx磷酸化激活AKT后，上调Ser9磷酸化的GSK-3β，抑制其活性而上调β-catenin激活下游复杂通路。用AKT特异性抑制剂LY294002治疗HBV感染，可以抑制磷酸化状态的AKT水平增加，同时磷酸化的GSK-3β的水平同样降低而导致β-catenin水平降低[15]。因此阻止GSK-3β磷酸化，刺激其活性可能成为阻止HBV相关HCC发生的一个有效治疗方向，其中AKT有望成为重要的靶标分子。

(二)SIRT2/AKT 哺乳动物信号调节子(silent information regulator ,SIRT)是一类依赖NAD+的哺乳动物组蛋白去乙酰化酶，调节衰老、凋亡、转录、炎症以及氧化应激[16]。在7个SIRT中，SIRT2蛋白尤其是1亚型(SIRT2.1)在细胞质中表达并促进HBV复制，在许多肝癌中过表达；高水平的SIRT2使化疗药物的作用效果大大降低[17]。有研究指出，HBx可以上调SIRT2的表达，而复制缺陷的HBV则会降低SIRT2活性，同样SIRT2在HBV复制和诱导的肝癌中也起着积极作用，这一过程并不依赖HBx。不仅如此，SIRT2对AKT的去乙酰化是其完全激活的关键，激活的AKT可以磷酸化抑制GSK-3β，从而激活下游一系列反应。因此HBx通过上调SIRT2/AKT而作用于GSK-3β，可以促进上皮间充质转化，促进肝癌细胞转移；高水平的SIRT2更是与更晚期的肿瘤分期和降低患者存活率相关[18]。

(三)ERK 与PI3K/AKT通路相类似，在正常生理中生长因子等因素可以通过激活Raf/MEK/ERK通路而磷酸化GSK-3β(Ser9)，从而发挥其糖原合成效应；在HBV感染细胞中，预先使用ERK抑制剂可以降低磷酸化GSK-3β水平，而抑制其下游效应[19]。

综上所述，HBx在HBV感染后HCC的发生中起着关键作用，稳定表达的HBx一方面通过激活AKT或ERK而磷酸化Ser9 GSK-3β；另一方面，HBx与SIRT2相互作用，正反馈完全激活AKT而磷酸化GSK-3β。除此之外，HBx蛋白还可以通过激活SCr激酶，上调Wnt/β-catenin信号传导，同时激活的SCr激酶又可以直接使GSK-3β Thr43处残基磷酸化，抑制其活性[12]。在复杂的信号网络，被抑制的GSK-3β恰好激活多种关键通路，刺激肿瘤发生以及癌细胞转移。

三、GSK-3β下游靶向分子

(一)Wnt/β-catenin Wnt信号通路由细胞表面受体和胞内传递信号的蛋白质组成，主要调节基因转录。广义上讲，Wnt通路分为经典和非经典通路，而Wnt/β-catenin是一条经典的Wnt通路。在没有信号刺激时，通路处于未激活状态，GSK-3β与结肠癌相关基因蛋白(adenomatous polyposis coli，APC)以及Axin结合形成蛋白质复合物与β-catenin结合，其中GSK-3β行使催化功能，磷酸化β-catenin的N端丝氨酸和苏氨酸，使其被识别并泛素化，最终被蛋白酶体水解。而在Wnt信号分子与胞膜上的FZD受体蛋白结合后，激活胞质内Dsh蛋白，使得GSK-3β磷酸化，解离GSK-3β/APC/Axin复合体，而致β-catenin聚集并核异位，与核内TCF/LEF家族转录调节因子结合，促进肿瘤相关靶基因转录，如c-myc、cyclin D1等[20, 21]。在此通路中，GSK-3β的活性关系到关键活性分子β-catenin不被降解而正常发挥其致癌功能。

β-catenin主要定位在细胞质或者细胞核中，在血清中也可以检测到。有研究表明，在慢性乙型肝炎以及HBV相关肝硬化患者血清中检测到β-catenin水平升高，而HBV相关HCC中并未有类似结果，这可能与HCC细胞较少出现自噬、坏死而活跃增殖以及β-catenin不断聚集以及核异位有关；同时表明血清中升高的β-catenin与HBV相关肝疾病进展呈负相关，为此β-catenin被认为可以作为诊断HBV相关疾病发展阶段的重要标志[15]。越来越多的实验表明，Wnt/β-catenin通路与许多疾病相关，尤其是肿瘤形成和癌细胞转移，同时也被认为是HBV诱发HCC的主要原因。有研究显示，多数HBV感染后发生HCC患者的HBx发生突变，转染突变的HBx可以观察到磷酸化GSK-3β水平升高，Wnt/β-catenin被激活，肝癌细胞的增殖和迁移情况活跃[22]。

有研究指出，通过胰岛素和Wnt两种途径的信号似乎调节不同的GSK-3β池。例如胰岛素激活下游AKT，而AKT磷酸化GSK-3β并不能影响β-catenin的聚集和移位，这也保证了正常细胞的生理状态。但用AKT特异性抑制剂LY294002治疗HBV感染，可以观察到磷酸化GSK-3β以及β-catenin水平降低，这可能归因于HBx介导的细胞信号的反式激活效应，同时也与不同细胞类型有关[23]。胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1 IRS1)基因的启动序列含有β-catenin的结合位点，HBx可以通过wnt/β-catenin通路激活而上调igr1表达，HBx也可以通过转录因子Sp1磷酸化上调IGF2和IGF1R的表达，激活IN/IGF通路，随后激活的PI3K/AKT和MAPK/ERK又可以激活Wnt/β-catenin而形成一个正反馈环，不断刺激感染细胞肿瘤发生和进展[12]。在此过程中，GSK-3β将其连接成信号网络，在促进β-catenin聚集以及核异位的过程中发挥关键作用，同时正反馈激活IN/IGF通路发挥抗凋亡功能。

(二)AR/ CCRK 据统计，HBV相关性肝癌流行病学特征有其突出的男性优势，即男女比例为5～7：1。在男性HBV携带者中，血清雄激素水平和雄激素受体(androgen receptor AR)激活水平与肝癌风险呈正相关[24]。在动物模型中，小鼠肝脏特异性敲除AR基因显著降低了HCC的发病率，进一步证实了AR在HBV诱导的小鼠肝癌模型中促进了肝癌的发生[25]。已有研究证实，HBx通过激酶途径促进AR二聚化和磷酸化，而提高AR的转录活性。AR的二聚化是通过AR的N-末端和C-末端的相互作用发生的。研究观察到GSK-3β调节AR N-C相互作用[7, 26]，HBx通过种种途径磷酸化Ser9位残基抑制GSK-3β活性，从而促进AR二聚化。随后，激活的AR与靶基因中的雄激素反应原件(androgen response elements，AREs)结合促进肝癌的发生。除此之外，激活的AR还识别HBV基因组增强子中保守的ARE，从而增加包括HBx在内的HBV基因的转录。因此，AR和HBx在HBV感染的肝细胞中形成了病毒-宿主正反馈环[25]，正是这种正反馈环加强了AR的激活以及HBV活跃表达。蟾蜍灵(Bufalin)是从中华大蟾蜍皮肤腺中提取的主要活性成分，被认为是通过阻断HBx/AR信号轴而抑制HBV相关HCC的细胞增生，同时有数据表明，蟾蜍灵在HBV相关HCC的治疗效果优于非HBV相关的HCC。由此说明HBx/GSK-3β/AR轴在HBV感染后HCC发生发展中的重要地位。

不仅如此，细胞周期相关激酶(cell cycle-related kinase，CCRK)是哺乳动物细胞周期蛋白依赖性激酶家族，是细胞增殖中不可或缺的激酶。有研究表明，CCRK是AR靶向的激酶，激活的AR上调CCRK的表达，高表达的CCRK通过磷酸化Ser9 GSK-3β抑制其活性而稳定以及募集β-catenin,通过β-catenin/TCF通路促进肿瘤发生以及癌细胞的生长，而磷酸化的GSK-3β又可以促进AR激活，形成作用环[27]。转染RNA沉默CCRK的基因，抑制了CCRK/GSK-3β/β-catenin/AR调控环，显著抑制了HBx诱导的肝细胞增殖和转化。

总而言之，HBV感染后通过HBx/GSK-3β/AR/CCRK轴一方面形成病毒-宿主正反馈环促进肿瘤发生；另一方面激活的AR通过CCRK/GSK-3β/β-catenin通路促进肿瘤细胞增殖转移。

(三)Cyclin D1 细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是细胞周期进程以及细胞增殖的重要调节因子，是癌症中最常改变的细胞周期调节因子之一。在正常有丝分裂细胞中，接受有丝分裂调节信号后，新合成的cyclin D1与胞质中周期蛋白依赖性激酶CDK4或CDK6结合组装形成的复合体蛋白，在细胞周期的G1中期转运并积聚于细胞核内，磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)及相关分子，从而激活转录进入S期所必须的E2F转录因子，最终进入正常的细胞周期。与β-catenin类似，具有活性的GSK-3β磷酸化cyclin D1的Thr286位残基，促进cyclin D1蛋白被蛋白酶体降解[28]。这种cyclin D1及时表达以及降解的平衡对于维持正常的细胞周期是至关重要的，在多种癌症中对于cyclin D1正常水平的干扰，是引起癌细胞活跃增殖的关键。

HBV感染细胞中高表达的cyclin D1参与了HCC的发生发展。然而在一些实验性的转基因小鼠的致癌模型中，仅cyclin D1的过表达并不足以诱发肿瘤[19]，提示虽说HBx可以在转录水平上激活cyclin D1，但仍有其他过程参与HCC发生。随后，在转染HBx细胞中过表达的HBx可以在肝癌细胞中异位表达，将cyclin D1蛋白的半衰期从40～60 min延长至80～110 min，同时检测到高水平Ser9磷酸化的GSK-3β以及Thr286磷酸化cyclin D1下降。此外共转染不同剂量的GSK-3β-S9A突变体以及HBV和cyclin D1后，可剂量依赖性抑制外源性cyclin D1表达，说明活性的GSK-3β可以逆转HBx对cyclin D1的诱导转录和稳定[19]。GSK-3β在稳定cyclin D1水平过程中起着关键作用。此外失活的GSK-3β同样可以稳定β-catenin水平，并促发cyclin D1基因转录，这也能很好地解释活性的GSK-3β可以逆转HBx对cyclin D1的诱导转录。

AKT、ERK等可以作为上游信号分子磷酸化Ser9 GSK-3β，使用ERK抑制剂U0126预处理细胞可显著降低HBx介导的cyclin D1增加，同时伴有磷酸化Ser9 GSK-3β的减少，但PI3K/AKT抑制剂LY294002不能达到这种效果。因此认为特异性ERK磷酸化的GSK-3β可以在HBx诱导cyclin D1转录以及稳定聚集的过程中发挥作用。

除了上述的三种重要的下游靶向分子，HBx通过不同通路磷酸化的GSK-3β还可以作用于其他分子，如稳定Snail蛋白而诱导HBV相关HCC上皮间质转化，促进癌细胞增殖迁移[29]；GSK-3β同样参与调节notch的稳定性，失活的GSK-3β失去其抑制notch的水解酶的能力，而促进功能性结构域的剪切和转运也即NICD的形成和转移，促进肿瘤的发生发展[30，31]。

四、小结

上述的众多细胞通路，显示了HBx/GSK-3β在HBV感染后HCC发生过程中的重要地位，同时表明激活GSK-3β可以作为延缓HBV相关疾病病程、阻止HBV相关HCC发生的一个重要的治疗方向，主要可以通过两种方式激活GSK-3β：①抑制GSK-3β上游因子如AKT、ERK、SIRT2等；②直接使用GSK-3β激活剂。虽然越来越多的研究显示GSK-3β在HBV相关HCC发生中占据了重要地位，但有关GSK-3β的相关药物还未经过充分的实验得到应用，GSK-3β在HBV感染者体内的各通路之间的相互作用、相关治疗方式的研究仍需深入探讨。