APP下载

睡眠剥夺大鼠喉上皮细胞屏障功能改变在咽喉反流发病机制中的作用△

2022-11-18郝梅蒋兴旺陈浩尹龙龙黎立张延平

听力学及言语疾病杂志 2022年6期
关键词:喉部屏障反流

郝梅 蒋兴旺 陈浩 尹龙龙 黎立 张延平

咽喉反流性疾病(laryngopharyngeal reflux disease, LPRD)是慢性咽喉炎的主要病因之一,一项临床横断面研究提示睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)是LPRD的独立危险因素[1],前期研究对慢性睡眠剥夺大鼠行咽部PH值监测,结果显示睡眠剥夺3月时大鼠出现咽喉部酸反流[2],组织学研究发现SD大鼠喉部黏膜出现明显的组织病理改变[3],但其具体发病机制尚不清楚。LPRD和胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease, GERD)的发病是上皮防御功能和侵袭因素平衡被打破的结果,而上皮细胞间的紧密连接(tight junctions, TJs)构成细胞防御的重要成员,其相关蛋白表达和分布异常可导致上皮细胞间隙增宽(dilated intercellular space, DIS),被认为是反流的特异性标志(Knowles等,2008)。有研究发现DIS 可诱导胃内容物反流至增宽的细胞间隙中,从而诱导黏膜本身趋化因子和细胞因子的释放,产生炎症反应,最终引起食管上皮屏障功能障碍,与GERD发生有关(Sonoda等,1999)。TJs由一系列膜蛋白构成,氧化应激反应可以通过诱导促炎症因子释放降低TJs蛋白的合成和组装,损伤其屏障功能[4],而睡眠剥夺是很强的应激原,通过引起氧化应激与多种疾病的发生和发展有关,因此,推测慢性睡眠剥夺可能通过氧化应激反应影响TJs从而与LPRD的发生相关。为验证上述假说,本研究动态监测慢性睡眠剥夺大鼠喉组织中TJs的主要成员闭锁小带蛋白1(zonula occludens 1,Zo-1)及闭合蛋白3(claudin-3)表达变化,为进一步探索睡眠剥夺与慢性咽喉炎和LPRD相关性的病理生理机制提供参考。

1 材料和方法

1.1实验动物及分组 健康成年雄性睡眠剥夺大鼠40只(购自北京市海淀区兴隆养殖场),体重250~280 g。随机分为4组,其中实验组分为睡眠剥夺1月组、睡眠剥夺2月组和睡眠剥夺3月组,对照组1组(大鼠使用普通鼠笼饲养,正常睡眠),每组10只。所有大鼠均可自由获取饲料(脂肪5%,蛋白质12%,碳水化合物46%)和饮水,饲养在标准实验室条件下,自动12 h光照/12 h暗循环,恒温(22~25 ℃),湿度50%~60%,适应环境3天后开始实验。所有实验动物的处理经解放军总医院第八医学中心动物伦理委员会批准,并与国家实验动物使用指南一致 。

1.2睡眠剥夺动物模型的建立[2]采用改良多平台水环境法建立大鼠慢性睡眠剥夺动物模型。实验各组大鼠按各组设定的持续时间每天剥夺睡眠8 h,时间为上午9点至下午5点。具体实验方案如下:将大鼠放入一个127 cm×45 cm×45 cm的水箱中,水箱均匀放置10个圆形平台(直径6.3 cm,高8.0 cm),水位达到平台以下1 cm,水温保持在20℃,每日更换水并清洗消毒水箱。大鼠可以在平台上自由活动,当大鼠进入快速眼动睡眠时因肌肉张力降低落入水中而被唤醒。

1.3喉组织取材 实验过程中,每日观察大鼠一般情况,各组按时间点造模结束后,称体重,以1%戊巴比妥钠腹腔注射,处死动物,剪开颈侧皮肤,去除肌肉,显露气管和喉腔,将会厌至环状软骨在内的喉组织取下,于矢状位正中线处纵行剖开喉腔,将标本分为两部分进行后续实验。其中采集对照组6个标本,睡眠剥夺1月组7个标本,2月组和3月组各6个标本。

1.4Western blot检测大鼠喉组织Zo-1及claudin-3蛋白表达 称取大鼠喉组织,按质量比1∶10加入预冷裂解液匀浆,冰上孵育20 min后离心,取上清,提取细胞总蛋白,按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明操作,测定蛋白浓度。行10%SDS-PAGE凝胶电泳,湿法转膜。采用5%脱脂奶粉室温封闭1h,然后加入兔抗大鼠Zo-1多克隆一抗(Proteintech, 1∶1 000)、claudin-3-抗(Abcam, 1∶1 000)、小鼠抗大鼠β-actin多克隆一抗(中杉金桥,1∶1 000),4 ℃孵育过夜。次日洗膜,添加二抗(Jackson,1∶10 000)孵育40 min,洗膜,添加ECL显影、曝光、拍照。

1.5实时荧光定量RT-PCR检测大鼠喉组织Zo-1及claudin-3 mRNA表达 使用Trizol试剂提取四组大鼠喉组织中Zo-1及claudin-3的RNA,紫外分光光度计检测mRNA浓度。加入逆转录反应体系,将RNA逆转录合成cDNA第一条链,再向cDNA模板中加入PCR预混液,ABI7500荧光定量PCR仪进行PCR扩增,扩增条件:95 ℃10 min,95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s, 72 ℃ 15 s,共 45 个循环,以 β-actin 为内参, 检测目的基因表达,2-ΔΔCt法计算Zo-1及claudin-3 mRNA相对表达水平;引物序列见表1。

表1 Zo-1、claudin-3以及β-actin引物信息

1.6统计学方法 采用STATA 15.0进行统计学分析。正态分布计量资料用均数±标准差表示,偏态分布计量资料以中位数(四分位数)[M(QL, Qu)]表示,正态分布计量资料采用方差分析比较四组数据的差异、bonferroni法比较两两差异。偏态分布计量资料采用Kruskal-Wallis比较四组的差异、Mann-Whitney比较两两差异;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1大鼠一般情况 实验组动物随睡眠剥夺时间延长,大鼠毛色下降,易激惹,夜间笼内喂养时群体间撕咬增加,在睡眠剥夺期间无动物死亡。实验组剥夺睡眠1、2、3月时体重依次为377.27±34.74 g、439.70±36.07 g、481.50±31.65 g;对照组体重为481.89±39.83 g,与对照组相比,睡眠剥夺1月组大鼠体重明显减轻(P<0.05),随睡眠剥夺时间延长,体重逐渐增加,3个月后体重明显接近对照组。

2.2Zo-1和claudin-3蛋白质表达 大鼠喉部组织Western blot 结果显示,实验组和对照组比较Zo-1和claudin-3蛋白表达不同,差异有统计学意义(P<0.05),与对照组比较,1月组与3月组Zo-1及claudin-3蛋白表达均降低,2月组Zo-1及claudin-3蛋白表达均升高,但差异无统计学意义(P>0.05);实验组两两比较示,睡眠剥夺3月组Zo-1蛋白表达明显低于2月组(P<0.05),2月组claudin-3蛋白表达较1月组明显上调(P<0.05),3月组较2月组明显下调(P<0.05)。3个实验组之间比较,随着睡眠剥夺时间的延长,Zo-1和claudin-3 蛋白表达呈现先降低、后升高、然后再降低的趋势(P<0.05,表2、图1)。

2.3Zo-1和claudin-3 mRNA表达 实时荧光定量RT-PCR结果显示,实验组和对照组相比,大鼠喉组织Zo-1和claudin-3 mRNA表达均不同(P<0.05),与对照组相比较,1月组及2月组Zo-1 mRNA表达均上升,3月组Zo-1mRNA表达下降,但差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比较,1月组claudin-3mRNA表达升高,2月组及3月组claudin-3mRNA表达降低,但差异无统计学意义(P>0.05);两两比较结果显示,睡眠剥夺3月组Zo-1mRNA表达明显低于1月组(P<0.05) ,2月组和3月组claudin-3 mRNA表达均显著低于1月组。睡眠剥夺1、2、3月组之间比较,随着睡眠剥夺时间的延长,Zo-1和claudin-3 mRNA表达逐渐降低(P<0.05,表2)。

表2 对照组及不同睡眠剥夺时间组喉部蛋白和mRNA表达量的比较

3 讨论

细胞粘附是维持组织结构稳定的基本条件,也是细胞运动和发挥功能的重要调节因素,目前发现的粘附结构包括TJs、缝隙连接、桥粒和粘附带,这些结构两个或两个以上同时存在时称为连接复合体。细胞之间的相互作用主要通过连接复合体完成,其中TJs位于连接复合体最顶端,是构成上皮机械屏障结构的最重要结构,具有重要功能。TJs由一系列跨膜蛋白和外周蛋白相互作用形成的蛋白体系组成,包括claudin、Zos、咬合蛋白(occludin)及连接黏附分子 (junctional adhesion molecules, JAMs) 等,其中claudin 蛋白是完整的膜蛋白,具有较强的黏附性能,是组成TJs的主要骨架蛋白,在相邻细胞间以 “拉链”状相互结合产生细胞旁封闭,对维持上皮细胞屏障以及TJs的完整性具有重要作用,上皮TJs链的形态学改变和屏障功能受损通常是claudin表达改变的结果(Sonoda等,1999年;Zeissig等,2007年)。目前发现的claudin蛋白家族一共有24个亚型,其中claudin-3 参与了TJs的选择性渗透和细胞极化,具有较高的组织特异性,在细胞间传输物质能量具有连接作用[5]。Zos属于外周胞浆蛋白,有三个异构体,其中Zo-1的相对分子量最大,在上皮细胞中主要定位于TJs和肌动蛋白之间,将claudin和细胞骨架连接起来,起固定和桥梁作用。因此,研究Zo-1和claudin-3的表达对于反应细胞TJs的结构和功能状态具有代表性。

研究发现睡眠剥夺与GERD的发生和发展密切相关,睡眠剥夺患者GERD患病率较高[6],睡眠质量会对GERD的程度和预后造成影响[7];睡眠剥夺与LPRD也存在相关性,前期的研究提示睡眠障碍是LPRD的独立危险因素,慢性REM期睡眠剥夺都可导致大鼠生理体位出现咽喉部酸反流,但其具体机制还不清楚。睡眠剥夺作为一种应激原,可以激活机体下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA轴),大量分泌儿茶酚胺和肾上腺皮质激素,增加代谢的同时产生了大量自由基,激活氧化应激反应[8],产生大量丙二醛(malondialdehyde,MDA)等代谢产物,影响蛋白的转录和翻译,从而与多种疾病的发生和发展相关[9];睡眠剥夺与这些疾病的相关性可能与改变细胞屏障功能有关[10-12],但有关睡眠剥夺对咽喉部黏膜的影响还未见报道。

GERD的发生和发展与食管黏膜上皮细胞的抗反流屏障功能改变密切相关。GERD患者食管粘膜上皮之间普遍存在DIS现象,目前认为其主要成因是TJs蛋白表达和分布异常[13],为胃酸、胃蛋白酶等胃十二指肠反流物能够直接进入粘膜下层提供了门户,导致局部诱导趋化因子和炎症因子产生,使上皮细胞屏障功能受到损伤(Souza等,2009),打破了食管防御机制和损害因素之间的平衡,与GERD的发生密切相关。有研究发现胃酸导致GERD大鼠食管组织中的claudin-3与TJs分离,引起该蛋白表达减少以及在细胞内的分布改变,进而引起了TJs复合物的不稳定,与上皮细胞间隙增宽和GERD食管细胞间通透性增加有关,因而提出claudin-3可能是一种GERD的特异而敏感的指标,适用于监测该病的炎症程度和恢复过程[14]。Xu等[15]的研究也发现,在GERD大鼠模型的喉部组织也出现了claudin-3表达下降情况,提出claudin-3可能也是反流性喉炎的敏感指标。Zo-1在GERD发生发展中的作用在不同物种和动物模型构建方法的研究中有所差异,但多数研究认为在反流性食管炎的食管组织中Zo-1表达下降[16,17],提出Zo-1表达的改变可能是食管粘膜TJs完整性丧失的基础,其中食管下段该蛋白的表达改变与GERD的症状显著相关[18]。关于LPRD患者喉组织中TJs表达的研究也发现Zo-1在人声带白斑病变组织中表达减少,提出咽喉部反流物可以引起细胞屏障功能障碍,可能是声带白斑发生的重要机制[19]。因此,claudin-3和Zo-1不仅与反流性疾病的发生和发展存在密切相关性,还可能参与了睡眠剥夺导致的细胞屏障功能改变,研究上述两种蛋白在喉部的表达情况将有助于探索睡眠剥夺引起喉部组织损伤的病理生理机制。

本研究间断性剥夺大鼠白天REM期的睡眠,观察不同时间喉部组织claudin-3和Zo-1两种蛋白的表达,可见,睡眠剥夺1月时大鼠喉部两种TJs蛋白表达低于对照组,随着睡眠剥夺时间的延长,到2月时其表达突然增高,而当睡眠剥夺总时间达到3个月时,其表达再次下降;睡眠剥夺1月组大鼠两种蛋白mRNA表达明显增高,出现与翻译后水平不一致现象,而当睡眠剥夺持续至2月时,mRNA相对表达量下降,至3月时降至最低点;提示claudin-3和Zo-1两种TJs蛋白在睡眠剥夺初期,翻译过程明显受到抑制,可能与此时大鼠外周血中MDA浓度较高和超氧化物岐化酶(super oxide dismutase,SOD)浓度较低有关,而高浓度的MDA可能通过干扰tRNA功能,使肽链延长暂时受限[20],抑制蛋白的翻译,这两种TJs关键蛋白表达的降低提示喉粘膜上皮细胞屏障功能可能在此时期已经出现障碍;睡眠剥夺1月时,大鼠外周血MDA浓度较高,提示大鼠代谢增强,消耗增加,同时素白翻译受到影响,与此时大鼠体重下降有关。但此时的氧化应激状态似乎并未对两种蛋白的转录造成负面影响,反而在这一阶段出现mRNA相对表达增加,可能反应了动物体内一种代偿机制,希望通过增加转录来增加蛋白翻译弥补细胞TJs的合成减少,转录和翻译的延迟可能造成了两者与对照组相比较的差异。随着睡眠剥夺时间的延长,动物体内抗氧化系统得到恢复,SOD浓度增加,MDA浓度下降,两种蛋白的翻译开始趋于正常,睡眠剥夺1月时出现的mRNA相对表达增加出现相应效应,使2月组大鼠出现喉部claudin-3和Zo-1两种蛋白明显增加;然而随着睡眠剥夺时间的进一步延长,大鼠脑肠轴功能受到严重干扰,影响胃肠功能和脑肠肽的分泌;睡眠剥夺3月时大鼠俯卧位出现咽喉部酸反流[2],而酸和其他胃内容物的介入,使得原本即将从睡眠剥夺中恢复正常的上述两种蛋白的表达再次受到冲击,反流物通过已经存在功能障碍的喉粘膜上皮屏障进入细胞间隙,引发新一轮的氧化应激反应和炎症反应,此时,上述两种蛋白表达再次出现降低,而且动物经受3个月睡眠剥夺和反流双重打击,自我代偿机制也出现了障碍,致使蛋白水平和mRNA水平出现一致性下降,这也可能是前期研究报道的睡眠剥夺大鼠喉粘膜病变要重于单纯高脂饮食大鼠[3]的原因之一。

综上所述,睡眠剥夺早期可能首先通过氧化应激干扰了大鼠喉腔粘膜上皮主要TJs蛋白的表达,使其细胞屏障功能出现障碍;而长时间的睡眠剥夺可能通过引发咽喉反流进一步破坏细胞屏障功能,与慢性REM睡眠剥夺大鼠喉腔组织结构的病变密切相关。关注睡眠障碍与慢性咽喉炎和咽喉反流的相关性有助于更好地预防和治疗上述疾病。

猜你喜欢

喉部屏障反流
咬紧百日攻坚 筑牢安全屏障
屏障修护TOP10
低压内缸落地凝汽器喉部结构设计
电子喉镜联合窄带成像技术对喉部早期恶性病变的诊断价值研讨
喉部超声检查对儿童嗓音疾病诊断的意义*
一道屏障
8个月的胃酸反流经历 苦难终于熬出头了!
维护网络安全 筑牢网络强省屏障
胃袖状切除术后并发胃食管反流的防治研究进展
胃食管反流病腔内治疗进展