微藻生物肥制备及农业应用研究进展

李武阳崔岩孟宪刚罗光宏

(1.兰州交通大学生物与制药工程学院，甘肃 兰州 730070；2.河西学院/甘肃省微藻技术创新中心，甘肃 张掖 734000)

随着世界人口不断增多，粮食需求量也日渐攀升。粮食生产过程中化肥的大量使用虽然极大地增加了粮食供应，却也带来一系列环境问题，如土地酸化、重金属污染、土壤板结、硝酸盐污染等，造成土壤肥力和作物质量下降[1]。因此，遏制农业生产过程对环境的负面影响，在确保粮食产量的同时减少化肥的使用，成为目前我国亟需解决的问题。国家统计局数据显示，自改革开放至今，我国农业化肥施用量从1 635.4万吨增长至6 022.6万吨，增长近3.7倍[2]。由于化肥的过量施用，给环境安全、食品安全及农业可持续发展等带来诸多影响，国家“十四五”规划中继续将化肥减量增效作为农业工作重点，寻找新型的传统化肥替代品，以保护生态环境、实现我国农业绿色发展。

生物肥料又称微生物肥料，是指含有特定微生物活体的制品，在农业生产中通过其所含微生物的生命活动促进作物生长，提高产量，改善农产品品质及农业生态环境[3]。生物肥料是一种高效、无污染和无公害的新型肥料，长期使用有助于建立土壤的良性循环，减少化肥使用，从而获得更好的经济效应和生态效应[4]。在不同类型生物肥料中，基于光合生物的制剂，如微藻生物制剂得到广泛关注与应用[5，6]。微藻是地球上分布最广、种类最多的一类形态微小、结构简单的光合自养微生物，在能量转化和碳循环中发挥着举足轻重的作用[7]。微藻能将水、二氧化碳和无机营养素(N、P、K等)转化为O2和蛋白质、维生素、抗氧化剂和动植物所需的其他营养物质[8]。因此，微藻能有效提高土壤肥力，促进植物生长，还可以改良土壤环境，提高土壤的保水保肥性能，修复被破坏的土壤，微藻生物肥被广泛应用于大田种植。本文就微藻生物肥的藻种选择、制备、应用方式及作用原理进行综述，以期为微藻生物肥的规模制备和农业应用提供一定的参考。

1 微藻生物肥的藻种选择及配方研究

土壤微藻作为土壤微生物的重要组成部分，是指土壤表层、土表下层及与土壤形成、演替和与土壤组成有关的各种类群的藻类集合群，在沙漠地、盐碱地、沼泽地、贫瘠地等农业种植艰难的地方均有微藻生存的痕迹[9]。土壤微藻种类主要包括:蓝藻门、绿藻门、裸藻门、金藻门和红藻门[10]，其中蓝藻门和绿藻门占据绝大多数并在农业领域有着广泛应用。文献报道的土壤蓝藻近40个属，主要包括色球藻属、平裂藻属、微囊藻属、螺旋藻属、颤藻属、席藻属、鱼腥藻属、拟鱼腥藻属和念珠藻属等。而隶属于真核藻类的土壤绿藻目前有112属，主要包括杜氏藻属、衣藻属、小球藻属、盘星藻属、栅藻属、团藻属、四孢藻属、胶球藻属、绿球藻属、集球藻属、四角藻属、纤维藻属、卵囊藻属、网球藻属、刚毛藻属、盘藻属、羽枝藻属、鞘藻属、转板藻属、新月藻属、鼓藻属和水绵属等[9]。随着研究的不断深入，其应用范围也不断拓展，如用作生物刺激剂、土壤改良剂和环境监测等[10，11]。

在农田应用中，藻种的选择对生物肥效的发挥至关重要。一种是使用单一的纯种藻株来促进作物生长。印度的研究人员于1939年最早在农田中接种固氮蓝藻来提高作物产量[12]。黎尚豪等[13]研究表明接种固氮蓝藻后水稻平均增产超过15%，最高达33%，验证了固氮蓝藻作为晚稻肥源的潜力。Chittapun等[14]研究发现，与对照相比添加蓝藻后促进水稻幼苗的生长和提高产量。Bumandalai[15]将番茄和黄瓜种子在含藻类菌株的培养基中培养发芽，结果表明在施加小球藻浓度为0.17 g/L和0.25 g/L时，番茄和黄瓜幼苗根长和芽长分别达到最高值，较对照显著提高。

另一种是采用混合微生物，包括不同微藻品种之间的混合以及微藻和细菌的混合。Taha等[16]研究了两种小球藻混合对玉米生长参数和土壤理化性质的影响，结果表明在2.5%藻液浓度下，玉米植株鲜重、干重最大增幅分别为44.3%、65.0%，叶绿素含量增加2.5%，土壤总氮也显著增加。Renuka等[17]研究了从污水中分离出的天然藻株MC1(由小球藻、蓝藻、绿球藻和红球藻组成)和MC2(由席藻、鱼腥藻、拟惠氏藻、飞氏藻和绿藻组成)的接种效果，结果表明，两种接种处理的微生物量碳均比肥料对照组提高31.8%~67.0%，75%N＋全剂量PK＋MC1处理组达到最大值；微藻制剂显著增加小麦根、茎长及根中氮、磷、钾含量，75%N＋全剂量PK＋MC2处理总氮含量最高，为3.56%；收获期接种微藻制剂处理的植株干重增加7.4%~33.0%，穗重增加10%；与肥料对照组相比，千粒重增加5.6%~8.4%，这表明将微藻混合接种作为生物肥料方施用，有望节省25%的氮并提高小麦产量。在实验室条件下，研究者通过严格的环境条件控制可获得纯净的藻种，但是在自然生态环境中，微藻和细菌不可能完全分离。研究发现，藻菌的交互作用对一些藻类生长有着积极的作用[18－21]。Rana等[22]利用从小麦根部分离出的菌株PW5(Providenciasp.)与微藻CW1(Anabaenasp.)、CW2(Calothrixsp.)和CW3(Anabaenasp.)进行田间试验，结果表明藻菌肥组(CW1＋PW5)相比于纯化肥组，小麦产量提高11%~16%。Zayadan等[23]利用稻田里分离出来的两株固氮菌(Anabaena variabilis和Nostoc calsicola)与小球藻混合制成藻菌肥ZOB1，在无氮培养中，ZOB1中微藻细胞与氧释放和二氧化碳固定相关的非环转运速率急剧增加，这表明其具有较高的光合活性。稻田施加ZOB1，种子发芽率较对照提高16%，芽长增加27%。同时进一步研究发现ZOB1能有效提高水稻对极端条件的抗性和生长速率并保证水稻在缺乏碳和氮素环境下正常生长。Kumar等[24]将嗜热菌和两种蓝藻混合研究其对植物生长的影响，表明茴香芽长和根长增加30%~50%，而香菜干重及芽和根的过氧化物酶活性均增加5~10倍，说明藻菌混合对作物生长有明显的促进作用。

2 微藻生物肥的制备及应用方式

虽然微藻生物肥相较于传统化肥有着较大优势，但农作物对肥料的需求量很大，按照传统的施肥方式需要规模化培养获得大量微藻生物质，这就需要培养、收获、干燥和保藏等一系列设备和场所，生产成本高。此外，微藻的培养受生态环境因素影响很大[25]。因此，需要进一步探究更高效的藻肥制备方式。

2.1 微藻生物肥的制备形态

目前市场上的微藻肥产品主要为液体制备形态，其中包含两大类:一类是基于全藻细胞制备的肥料，其优势在于微藻细胞可存活且具有活性；另一类是基于提取微藻活性物质制备的肥料，目的是挖掘功能独特的成分。微藻含有大量农作物生长必需的生物活性物质，包括藻多糖及其衍生物(寡糖)、特殊脂肪酸、氨基酸、小分子肽、天然色素、矿物质、植物激素、微量元素、抗生素、酚类、萜类等[26，27]。国内液体藻肥的生产厂家主要有地福来和阿尔格，其生产的活性藻液产品对作物生长有很好的促进作用。国外在这方面的研究起步早，技术较为成熟，代表的企业有西班牙的AlgaEnergy公司，该公司于2015年底推出了世界第一批基于微藻的生物刺激素产品，用于提高作物栽培效率。

2.2 微藻生物肥的应用方式

微藻生物肥的农田应用方式主要有生物质直接投放和载体添加两种方式。前者将生物质按照一定比例用水稀释后，通过浇灌或者喷淋的方式作用于植物，通过微藻自身代谢活动促进植物生长。这种方式成本低、简单易行，但考验藻种在不同环境条件下的繁殖能力。后者是通过不同载体将微藻固定，以增强细胞在不同环境下的适应能力，目前应用的载体类型包括小麦秸秆、稻草堆肥、蛭石、粘土、动物废弃物和农业废弃物等[28]。Prasanna等[29]利用蛭石作为稻田蓝藻增殖的有效载体，通过测定土壤相关指标，发现土壤微生物量碳和腐殖质含量有显著提高。Dhar等[30]评估了新型蓝藻生物肥(载体为麦秸和漂白土)制剂与传统土壤基BGA生物肥料对水稻产量的影响，发现，以麦秆和漂白土为载体添加75%氮肥，可获得最高的籽粒产量。随着科学技术的发展，新材料的发明和应用将大大提高微藻肥料的效率。

3 微藻生物肥的作用效果及原理

近年来化肥的大量施用虽然增加了作物产量，但也造成一系列环境问题，某些化学元素过分积累，残留于土壤，造成土壤结构板结；进入水体使得水体富营养化，形成水华或赤潮；经土壤反硝化作用形成N2O进入大气，破坏臭氧层，危害人类健康[31，32]。土壤中的微藻可以通过微生物代谢活动来提高土壤肥力、分泌植物生长刺激素、提升作物抗病虫害能力，进而提高作物产量，可以有效减少农业生产过程中化肥的使用[33]。

3.1 提高土壤肥力

3.1.1 固氮作用 土壤氮含量极大地影响着作物产量，同时也是农业生产中的较大投入，但约有一半化肥(如硫酸铵、尿素等)不能被作物有效利用而流失到环境中[34]。固氮蓝藻是地球上年固氮量仅次于豆科植物和根瘤菌共生结合体的固氮生物，是重要的可利用生物氮肥资源。Pereira等[35]研发出一款含固氮蓝藻的生物肥，发现水稻田接种固氮蓝藻可以使得化肥施用减少至50%(N 50 kg/hm2)，并且保障产量维持不变。Valiente等[36]通过15N标记法研究蓝藻对N的固定，结果表明土壤氮是水稻氮的主要来源，而施加的氮肥只有8%~14%被水稻吸收，土壤－植物体系对硫酸铵的吸收率低于50%。土壤－植物系统对标记蓝藻氮的吸收率高于化肥组，20天后，仍能在水稻体内检测到蓝藻所固定的氮。这说明蓝藻肥的固氮效率和持久力远高于普通氮肥。孔德柱等[37]研究固氮鱼腥藻在小麦和番茄上的肥效，结果表明，90天后，施用藻肥的土壤含氮量提高4.16倍，维持在0.075%左右；同时研究发现，固氮鱼腥藻肥初施阶段土壤氮含量很低，仅为0.023%，之后逐渐增加，30天时土壤氮含量达到0.066%，之后增速变缓，60天达到平衡点，氮含量为0.073%。这说明固氮鱼腥藻在土壤中能够持续固定空气中的氮，有望开发成为环境友好、肥效持久的生物肥料。

3.1.2 解磷作用 磷是作物生长过程中所必需的主要营养元素之一，直接影响着作物产量和品质[38]。土壤中磷的形态可分为有机态磷和无机态磷，后者包括矿物态磷、吸附态磷和水溶性磷。其中，水溶性磷是最有效的部分，是可供植物利用的主要形态，但在土壤中含量较少，而前者却不能被植物直接吸收利用，只能通过矿化分解间接为植物提供磷素[39]。所以需要向土壤直接补充化学磷肥，但只有部分化肥能被作物吸收，大量磷因侵蚀和淋溶而流失，污染地下水，造成地表水富营养化[40]。Bose等[41]研究发现微藻在生长过程中释放的酸类化合物可以通过溶解含钙磷化物来释放磷。Mazhar等[42]利用从稻田中分离的蓝藻菌株作为生物肥料，测试其对磷酸盐的溶解能力，结果显示选定的两种蓝藻菌株SM－14和SM－15都能够很好地溶解磷酸盐。微藻还能将土壤中有机磷转化为无机磷。Ghyoot等[43]研究了磷酸盐限制下球囊藻中碱性磷酸酶活性及微藻将有机磷转化为无机磷的机制，表明在无机磷缺乏时，微藻可以利用各种形式的有机磷并转化为无机磷进而提高土壤磷含量。

3.1.3 固碳作用 微藻是农业生态系统中有机物的重要来源。微藻生长周期短、光合效率高，其CO2固定效率为一般陆生植物的10~50倍[44]。Karthikeyan等[45]从小麦根系分离出3株微藻[Calothrix ghosei(K1)，Hapalosiphon intricatus(K2)andNostocsp.(K3)]，将其按照一定比例制作成生物肥施入小麦田中，结果表明土壤有机碳含量比未接种的对照组高两倍以上，比全剂量化肥处理高80.58%，这说明微藻能有效增加土壤中有机碳浓度。Nisha等[46]采用盆栽试验研究蓝藻对半干旱土壤生产力的影响，将用3株蓝藻配组的有机肥应用于缺乏有机物的半干旱土壤中(有机碳总TOC 0.34%)，在缺水(土壤水分6%~12%)条件下，施后90~180天时TOC含量增加50%，说明微藻在极端条件下也能发挥很好的生物固碳能力。凌丽俐[47]研究发现，在光合作用下土壤藻类数量变化与有机质的相关性十分密切，达到极显著水平，表明藻类对土壤有机质的提高有明显影响。

3.2 分泌生长刺激素

微藻可以通过分泌生长因子来促进植物的生长和发育，这些生长因子包括植物激素、氨基酸、维生素(如维生素B12和维生素H)、多糖和多肽[26，48]。它们通过促进植物的代谢反应，如呼吸作用、光合作用、核酸合成、叶绿素产生和离子吸收等提高种子发芽率和植物生长指标(增加枝条和根的长度，增加叶面积和营养成分含量)[49]。El Arroussi等[50]研究从杜氏盐藻提取的脯氨酸、类胡萝卜素和胞外多糖对盐胁迫条件下小麦幼苗萌发和生长的影响，结果表明，从微藻中提取的胞外多糖对小麦种子的萌发和幼苗生长有重要的刺激作用；与空白对照组相比，盐胁迫浓度3 g/L和6 g/L条件下小麦种子的萌发率分别提高96%和83%，根长提高1.33倍和4.44倍，胚芽鞘长提高1.05倍和7.50倍。这表明杜氏盐藻提取物，特别是胞外多糖提取物可以缓解植物盐胁迫，并提高作物产量。Ramya等[51]制备了不同浓度的裸藻液体提取液，作为叶面肥喷施于盆栽茄子幼苗，表明其可有效提高茄子的一些生理生化指标，株高提高30%，植株干重提高25%，叶面积提高61%，含水率提高56%；叶绿素含量提高77%，蛋白含量提高38%，还原糖含量提高201%，抗坏血酸含量提高36%。El Arroussi等[52]将柏氏螺旋藻总多糖提取物(TPE)应用于番茄和辣椒中，当TPE处理浓度为3 g/L时番茄和辣椒主茎长分别增加20%和30%，叶面积增加57%和100%，叶片数增加33%和50%；TPE处理对番茄根重的影响较辣椒(提高67%)更为明显(提高2.30倍)。

3.3 提升作物抗病虫害能力

在农业生产中化学农药的大量使用使得农药残留在食物链中不断积累，生态系统遭到破坏[53]。为此需要探索可持续的病原体控制替代方法，防止植物病害传播，以建立高效和可持续的农业生产方式，减少农业中的化学农药投入[54]。近年来，研究人员发现，微藻提取物对植物致病菌和真菌具有抗菌作用，而且蓝藻代谢物能够通过破坏线虫的孵化过程来达到抑制线虫生长的效果。

3.3.1 抑制病原菌 研究发现蓝藻通过产生某种抗菌化合物，对病菌细胞膜的结构和功能进行破坏并降低相关酶的活性和抑制蛋白质合成从而达到抑制病原菌的效果[55]。Prasanna等[56]评估了70种微藻对一组植物致病菌的生物灭活性，其中35种微藻产生了抑制区，这些微藻产生的水解酶、壳聚糖酶和具有杀菌活性的木聚糖酶对菌株产生了抑制作用。Ordog等[57]对174株绿藻和23株蓝藻的抗菌能力进行评估，筛选出10株具有较高抗菌活性的绿藻菌株。经验证，这些藻株对革兰氏阳性菌(10种中有9种)和革兰氏阴性菌(10种中有7种)均表现出较高的抗菌活性。Chaudhary等[58]研究了两种蓝藻(RPAN59和RPAN69)的复合菌剂对选定的植物病原真菌(ITCC95)、根菌(ITCC4578)、镰刀菌(ITCC4223、ITCC4998)在番茄幼苗上的抑制能力，表明患病植株在施加微藻复合菌剂后一些生长指标有显著提高，比化学农药处理植株鲜重提高10%~15%，株高增加40%~50%。

3.3.2 抗虫害 微藻能够通过产生肽毒素和杀线虫化合物来有效减少线虫等植物害虫的数量[59]。Khan等[60]在温室条件下，将番茄幼苗用不同浓度的微藻(0.2%、0.5%、1%、2%、10%、50%和100%)培养滤液浸泡30 min，与对照相比，浸根处理的效果随着浓度的增加而增加，最高浓度处理线虫数量减少可达97.5%。Holajjer等[54]研究蓝藻对线虫的杀虫活性，发现蓝藻提取物使得线虫幼体(J2)的最大不动率达到94.2%，死亡率达到29.3%，蓝藻在土壤中的应用可以降低线虫感染，提高作物产量。Khan等[61]在盆栽试验中加入蓝藻粉，当浓度达到0.8%(w/w)时，与对照组相比，土壤根系中的线虫数量减少97.6%。

4 展望

微藻已被证明有助于提高土壤肥力、促进作物生长以及提升作物抗病虫害能力，但目前技术的不够成熟和研究的不够深入限制了微藻生物肥的广泛使用。在实现其规模应用之前还需解决以下问题:(1)目前可用于工业化生产的藻种较少，未来需进一步筛选优质藻种，期望能够在获得生物质的同时，利用其固碳能力实现零碳生产模式。(2)微藻生物质生产和加工的成本导致微藻生物肥、生物刺激剂和生物杀虫剂等产品的成本增加，其价格无法与化学产品在市场上竞争。因此，目前微藻生物质通常在经济价值较高的产品(保健品、制药和化妆品行业)中应用较为广泛，降低微藻生物质的获取成本是需要攻克的方向之一。(3)研究微藻生物肥在不同作物品种和不同土壤类型中的作用效果，开发适合我国主要作物和土壤现状的产品。(4)目前，关于生物肥活性保护技术研究较少，菌体的活性保持时间限制了肥料的使用效果，因此需要对生产工艺进一步优化和提升，获得性能稳定的产品。(5)微藻生物肥的肥效已在实验室和大田应用中获得广泛验证，但对微藻及其提取物、植物和环境之间的相互作用仍然知之甚少，未来需要在作用机制方面进行更加深入的研究。