木霉缓解外源草酸对黄瓜幼苗毒害的作用研究

吴晓青，任何，吕玉平，赵晓燕，周红姿，张新建，杨合同

(1.齐鲁工业大学(山东省科学院)生态研究所/山东省应用微生物重点实验室，山东 济南 250103；2.山东新时代药业有限公司，山东 临沂 273400；3.中国科学院分子植物科学卓越创新中心，上海 201602)

草酸(oxalic acid，OA)是简单的有机二元酸，核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰霉菌(Botrytis cinerea)等病原菌在侵染植物过程中分泌的外源草酸(相对于植物细胞内源草酸而言)不仅是非特异性植物毒素，还能通过降低侵染环境的pH值，一方面诱导自身细胞壁降解酶(聚半乳糖醛酸酶、天冬氨酸蛋白酶、漆酶等)活性提高，另一方面抑制植物保护酶的活性，连同抑制植物氧爆作用、调节气孔保卫细胞关闭、诱导植物细胞程序性死亡等参与到侵染机制中[1，2]。盾壳霉(Coniothyrium minitans)、木霉(Trichoderma)等生防功能菌在拮抗核盘菌、灰霉菌时会通过产生草酸脱羧酶(oxalate decarboxylase，OXDC)消除外源草酸的作用，从而阻止病原菌对植物的侵染[3－6]。但一定浓度的外源草酸又是有效的化学诱抗剂，能显著提高植物对病原菌的系统抗性[7，8]。因此，明确外源草酸的毒性作用和诱抗作用浓度对合理利用外源草酸具有重要意义。

前期工作中，我们已对一株防治黄瓜灰霉病的非洲哈茨木霉(T.afroharzianum)LTR－2降解草酸的作用及机制进行了研究，本研究在此基础上，分析了不同浓度草酸浸根及接种木霉对黄瓜幼苗的毒害程度和叶片中4种抗性酶(两种抗氧化酶和两种抗病相关酶)活性的影响，以期进一步了解木霉在黄瓜幼苗抗性系统响应外源草酸胁迫中的作用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株为非洲哈茨木霉LTR－2，由山东省应用微生物重点实验室分离自土壤并保藏。“津研四号”黄瓜(Cucumis sativusL.)种子，购自天津市津科力丰种苗有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 黄瓜育苗及取样 2020年4月，在无菌条件下将黄瓜种子先后浸入75%乙醇和次氯酸钠溶液(有效氯含量2%)中表面消毒30 s和15 min，无菌水冲洗2~3次，转移至湿润的滤纸上，于25℃暗培养2 d，待胚根伸长至1~2 cm时移入折叠式育苗钵中，置于恒温光照培养箱中，在光照25℃12 h、黑暗18℃12 h培养。育苗基质为普通园艺基质，购自济南鲁青种苗有限公司，使用前经121℃、103 kPa灭菌2次，每次1 h，间隔24 h。待幼苗长出3~4片真叶时，翻转折叠式育苗钵取出完整植株，用无菌水淋洗去除根部附着的育苗基质。

1.2.2 木霉发酵及草酸处理方法 无菌条件下，将活化的0.5 cm木霉菌块接入PDA(potato dextrose agar，BD，USA)平皿中央，在25℃、光照12 h、黑暗12 h条件下培养7 d；用接种环轻轻刮取分生孢子层，混入无菌水中，灭菌脱脂棉过滤制成孢子悬浊液，利用血球计数法调整孢子浓度为107个/mL，备用。将100 mL PDB(potato dextrose broth，BD，USA)分装于500 mL三角瓶中，于115℃、90 kPa灭菌25 min。配制0.5 mol/L草酸(分析纯)母液，通过0.22μm无菌聚醚砜滤膜过滤除菌，在PDB中添加不同比例的草酸母液使草酸终浓度分别为0、10、20、30、50、80 mmol/L。将100μL上述木霉分生孢子悬浊液接种至含不同浓度草酸的100 mL PDB中。以无菌蒸馏水处理、空白PDB培养基处理、接种木霉的PDB发酵滤液处理为对照。所有处理的培养液均在160 r/min、28℃条件下振荡培养5 d。为了方便描述，将处理组和对照组进行编号，如表1所示。

表1 处理及编号

1.2.3 浸根法处理黄瓜幼苗 将各处理的木霉发酵液经10 000 r/min离心和0.22μm聚醚砜滤膜抽滤彻底去除菌体，滤清后的处理液转移至灭菌的500 mL烧杯中，同时取出10 mL处理液用pH计测定pH值。从育苗钵中小心取出完整苗体，用清水洗净根系，用打孔的PVC板将黄瓜幼苗固定在处理液上方，使根系下端浸于处理液中。每瓶插入2棵黄瓜幼苗，每处理设6瓶重复。在25℃条件下放置24 h，拍照并进行统计。

草酸毒害程度的统计方法:中毒严重度分为4个级别，0级为所有叶片挺阔，根茎饱满；1级有1~2片真叶轻度萎蔫，根茎挺拔；2级有2~3片真叶萎蔫，根茎软化；3级有3片及以上真叶萎蔫，根茎下部失绿萎缩；4级为整体植株萎蔫，根茎整体萎缩严重。每个处理重复3次。参考病情指数的计算方法计算中毒指数，具体公式为:中毒指数＝(N0×0＋N1×1＋N2×2＋N3×3＋N4×4)/每处理总苗数，其中N0、N1、N2、N3和N4分别为各级别的黄瓜幼苗数。以每瓶的两棵幼苗为一个重复，采集叶片，每个处理重复3次，用液氮速冻后研磨成细粉，待测酶活。

1.2.4 酶活性测定 苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)活性分别采用苏州科铭的PAL、SOD、CAT、PPO试剂盒(微量法)测定。

1.3 数据处理与统计分析

采用Microsoft Excel 2019软件进行平均值和标准差计算，用SPSS 22.0进行Duncan’s多重检验，使用Origin 8.0绘制图表。

2 结果与分析

2.1 木霉处理降低外源草酸对黄瓜幼苗的胁迫

黄瓜幼苗在各处理条件下处理24 h后呈现出不同程度的生长状态(图1)。无菌水处理(H2O)的黄瓜幼苗叶片挺阔、根茎茁壮饱满(图1 A)；PDB培养基处理(PD)后，叶片边缘出现轻度脱水现象、根茎挺拔(图1 C)；木霉发酵液处理(T)后，黄瓜幼苗状态与PD处理的相似(图1 D)。10 mmol/L草酸处理(OA10)的黄瓜叶片出现萎蔫，根茎轻微脱水但未见明显萎缩(图1 E)；同草酸浓度的木霉处理(T＋OA10)后，幼苗叶片萎蔫程度降低、根茎恢复挺拔(图1 F)。20 mmol/L草酸处理(OA20)对黄瓜幼苗的胁迫作用明显，叶片全部萎蔫，根茎出现萎缩失绿及软化现象(图1 G)；同草酸浓度的木霉处理(T＋OA20)有效缓解了叶片的萎蔫状况，根茎轻度萎缩，少有失绿软化现象(图1 H)。当草酸浓度达到30 mmol/L(OA30)时，植株整体严重萎蔫，根茎部变白软化(图1 I)；同草酸浓度的木霉处理(T＋OA30)则可改善部分生长较粗壮植株受胁迫的状况(图1 J)。当草酸浓度提高至50、80 mmol/L时，幼苗萎蔫情况愈加严重，木霉处理也无明显缓解作用。

图1 不同处理黄瓜幼苗的表型

利用中毒指数对胁迫程度进行量化，结果表明，10~30 mmol/L草酸对黄瓜幼苗均有不同程度的毒害作用，而木霉处理显著缓解了草酸对黄瓜的胁迫，10、20、30 mmol/L草酸处理下，接种木霉后的幼苗中毒指数分别降低50.00%、41.18%、22.22%(图2)。

图2 不同处理黄瓜幼苗的中毒指数分布

2.2 木霉缓解草酸处理对黄瓜PAL活性的影响

结果(图3)表明，H2O处理的PAL活性为(28.91±2.32)U/mgFW，PD、T处理后的PAL活性分别为(31.80±0.67)(17.04±4.04)U/mgFW，三者间差异不显著。与PD处理相比，不同浓度草酸处理均使PAL活性显著升高(P<0.05)，表现为OA80>OA30>OA50>OA20>OA10；不同草酸浓度下接种木霉后，幼苗中的PAL活性也均高于PD处理，表现为T＋OA30>T＋OA50>T＋OA80>T＋OA20>T＋OA10，除T＋OA10、T＋OA20处理外差异均达显著水平(P<0.05)。相同草酸浓度下，接种木霉处理的PAL活性显著低于未接种的。可见，各草酸浓度下接种木霉均抑制了黄瓜幼苗PAL活性的升高。

图3 不同处理黄瓜幼苗叶片的PAL活性

2.3 木霉缓解草酸处理对黄瓜PPO活性的影响

结果(图4)显示，PD、T处理后PPO活性分别为(33.66±1.10)(38.10±1.10)U/gFW，两者间差异显著，但均与H2O处理[(37.29±0.80)U/gFW)]无显著差异。与PD处理相比，草酸处理后黄瓜幼苗叶片中的PPO活性均显著提高(P<0.05)，表现为OA20>OA30>OA80>OA10>OA50；不同草酸浓度下接种木霉后，PPO活性也均升高，表现为T＋OA30>T＋OA50>T＋OA20>T＋OA80>T＋OA10，除T＋OA10处理外均显著高于H2O、PD、T处理(P<0.05)。相同草酸浓度下，与不接种木霉处理相比，接种木霉的T＋OA30和T＋OA50处理显著提高黄瓜幼苗叶片中的PPO活性，而其余接种木霉处理均显著降低PPO活性。可见，接种木霉对PPO活性的提升作用在30、50 mmol/L草酸处理下最明显，草酸浓度过低或过高都不能发挥其对PPO活性的提升作用。

图4 不同处理黄瓜幼苗叶片的PPO活性

2.4 木霉缓释草酸处理对黄瓜CAT活性的影响

结果(图5)显示，H2O处理的CAT活性为(2 374.39±466.04)nmol/(min∙mL)，PD、T处理后活性分别为(2 985.38±528.45)(1 343.62±348.17)nmol/(min∙mL)，其中T处理的CAT活性最低，显著低于H2O和PD处理(P<0.05)，仅为PD处理的45.01%。相比于PD处理，不同浓度草酸处理的CAT活性表现为OA80>OA20>OA30>OA10>OA50，其中，OA20和OA80处理显著高于PD处理(P<0.05)，其余浓度草酸处理与PD处理无显著差异；不同草酸浓度下接种木霉后，黄瓜幼苗叶片中的CAT活性均降低，表现为T＋OA50>T＋OA10>T＋OA20>T＋OA30>T＋OA80，其中，T＋OA10和T＋OA50处理与PD处理差异不显著，但显著高于T处理(P<0.05)，其余处理均显著低于PD处理，与T处理差异不显著。相同草酸浓度下，整体来说接种木霉处理的CAT活性低于不接种木霉的，尤其当草酸浓度为20、30、80 mmol/L时，接种木霉显著抑制了黄瓜幼苗叶片中的CAT活性。

图5 不同处理黄瓜幼苗叶片的CAT活性

2.5 木霉缓解草酸处理对黄瓜SOD活性的影响

结果(图6)显示，PD处理黄瓜幼苗叶片中的SOD活性最高，为(7 771.16±846.55)U/gFW，与H2O处理[(7 754.36±374.00)U/gFW]差异不显著；T处理的SOD活性[(3 755.00±1124.93)U/gFW]显著低于两者(P<0.05)，仅为PD处理的48.32%。相比于PD处理，各浓度草酸处理均降低幼苗叶片中的SOD活性，接种木霉菌后降低效果更明显，除OA20处理外差异均达显著水平(P<0.05)；随草酸浓度的升高，不接种木霉时SOD活性先升高后降低，OA20处理的最高，而接种木霉后SOD活性逐渐降低。相同草酸浓度下，相比于不接种木霉，接种木霉降低叶片中的SOD活性，草酸浓度为20 mmol/L时差异达显著水平(P<0.05)，其余浓度下差异不显著。

图6 不同处理黄瓜幼苗叶片的SOD活性

3 讨论与结论

一定浓度的外源草酸对于植物是非专化性毒素，如用浓度为8 mmol/L以上的草酸浸根处理3 d或10 mmol/L以上的草酸处理叶片24 h均可使油菜产生中毒症状，主要表现为叶片黄褐腐化和根茎脱水萎缩，处理浓度越高、时间越长，受害程度越重[6，9]。黄瓜含水量高，根际含水量达80%~90%，对溶液中毒性胁迫因子更为敏感[10]，本试验结果也显示，用10~80 mmol/L草酸浸根处理黄瓜幼苗24 h后表现出与无菌水和PDB培养基对照处理差异显著的发育形态，表明黄瓜幼苗耐草酸胁迫的能力较差；接种木霉可在一定程度上缓解10~30 mmol/L外源草酸对黄瓜幼苗的胁迫作用，使幼苗的中毒指数降低22.22%~50.00%，但对50~80 mmol/L外源草酸的胁迫作用无明显缓解。前期研究表明，在草酸浓度低于20 mmol/L的培养液中接种木霉并培养5 d，草酸可完全被降解，降解率达100%；而当草酸浓度为30 mmol/L时，降解率大幅降低至不到20%；当草酸浓度继续升高后，木霉自身生长也被显著抑制，对草酸的降解作用就更加微弱[11]。

PAL与植物抗毒素及酚类化合物的形成密切相关，虽不能直接抵御病虫害，但可通过苯丙烷类途径进一步转化为木质素、黄酮、异黄酮、生物碱等次生代谢产物以增强植物的抗病性[12]。PPO是植物体内普遍存在的一类铜结合酶，分为单酚单氧化酶(tyrosinase)、双酚氧化酶(catechol oxidase)和漆酶(laccase)，其活性与植物抗病有关，能参与植物的次生代谢，产生一些毒性物质，直接毒杀病原菌[13]。CAT广泛存在于植物中，可催化细胞内过氧化氢的分解，防止过氧化，主要与抗逆性和氧化衰老等生理过程有关。植物遭受生物和理化因子伤害时，产生的活性氧自由基(ROS)在传递和放大信号过程中可改变离子的分布和启动核基因的表达，并在一定范围内诱导提高植物对各种胁迫的耐受性，而CAT可清除过多的ROS以使其保持在一定的浓度范围内[14]。SOD是一类具有特定催化功能的蛋白质，广泛存在于植物中，是活性氧清除过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，可将O2∙－快速歧化为H2O2和分子氧，对防止氧自由基破坏细胞的组成、结构和功能具有十分重要的作用[15]。为进一步探究木霉缓解草酸毒害的机理，本研究分析了各处理下黄瓜幼苗叶片中这4种抗性酶的活性变化，结果表明，与PD处理相比，仅接种木霉的T处理降低PAL、CAT、SOD活性，尤其CAT、SOD活性降低显著，但显著增加PPO活性；添加草酸能大幅提高PAL和PPO活性，降低SOD活性，对CAT活性的影响多不显著；而接种木霉可有效缓解外源草酸对PAL和PPO活性的影响，进一步降低SOD和CAT活性，总体来说，外源草酸浓度低于20 mmol/L时，接种木霉对降低其胁迫作用的效果较好。前人对接种木霉菌株引发的植物抗性酶活性变化也进行了一些研究[16－20]，但不同木霉菌株引发的不同植物的抗性酶响应模式不同，甚至同一菌株对不同植物抗性酶系统的作用也不同；另外，不同作物的抗性酶系统对不同浓度草酸胁迫的响应也不同[21，22]。造成上述差异的原因还有待进一步研究。

综上，木霉对草酸具有一定降解作用，接种木霉能有效缓解低浓度(10~20 mmol/L)外源草酸对黄瓜幼苗的毒害。这可为进一步研究木霉对植物响应外源草酸胁迫的影响提供参考。