全麻药物对未成熟大脑神经毒性作用的研究进展

王蓓 朱智瑞 胡智勇

现代麻醉学的出现与发展，使得数以万计的患者能够安全地耐受一些诊断性治疗，平稳渡过手术过程。早期研究认为全麻药物诱导出的大脑镇静状态具有可逆性，但是部分患者麻醉苏醒后表现出谵妄、记忆力减退及较长时间的认知功能下降等症状，推测全麻药物可能存在神经毒性。对啮齿类及灵长类动物的研究结果证实：大脑尤其是未发育成熟的大脑暴露于全麻药物，可能触发中枢神经系统（central nervous system,CNS）形态及功能的长远改变，并引起随后的认知障碍、行为异常及情绪改变[1-3]。最近的一项荟萃分析结果显示，接受单次全麻手术的儿童出现内化行为（包括抑郁、焦虑、身体不适和青少年自杀等状态）的风险增加了47%，执行功能障碍的风险增加了68%[4]，提示人类幼年麻醉暴露与认知、行为发育密切相关。脑发育涉及诸多复杂的细胞进程，包括神经发生、分化成特定的类型、迁移到特定的位置、形成突触之间的精细化连接从而构成神经环路以及形成轴索、髓鞘等，这些进程具有时间特异性和持续性。人类神经发育的关键时期为妊娠晚期至婴幼儿期，啮齿类动物则为出生前2天至出生后2周内，因此全麻药物的药理学干扰在这些阶段尤为显著和持续。本文整理了全麻药物对未成熟大脑神经毒性作用的最新研究进展，阐述未成熟大脑麻醉暴露的神经毒性机制，并对潜在的保护性策略作一综述。

1 全麻药物与认知功能障碍

1.1 动物研究Ikonomidou等[5]首次发现N-甲基-D-天门冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor,NMDA）受体拮抗剂氯胺酮可导致神经元非正常凋亡，提示全麻药物可能存在神经毒性。Jevtovic-Todorovic等[1]复合使用临床儿科麻醉常见的几种全麻药物（包括咪达唑仑、氧化亚氮、异氟醚）以足够耐受手术刺激的剂量对出生后第7天（postnatal day 7,P7）的小鼠处理6 h，小鼠成年后的水迷宫实验和八臂迷宫实验结果显示，麻醉暴露组小鼠的空间学习和记忆能力要显著弱于对照组，且在发育过程中伴随大量神经元退化性凋亡与海马突触功能障碍。Talpos等[2]将与人类基因同源性高达94%的P5/P6恒河猴暴露于异氟醚与氧化亚氮的混合物中，待其7月龄时进行学习、记忆、颜色辨别和动机测试等认知训练与测试评估，结果显示麻醉组恒河猴在测试中反应能力和学习能力均显著下降。该结果支持了早期长期麻醉可能会增加日后发生认知障碍风险的假设。啮齿类[1，3，6]、鱼类[7]及灵长类[2]等多种动物模型实验均表明几乎所有的临床全麻药物都可引起未成熟大脑的神经发育受损。

1.2 临床研究临床研究中通常以幼年时接受过手术麻醉暴露的儿童为暴露组，以当地同龄的健康儿童为对照组，通过比较两组儿童学习成绩或智力、行为发育量表测评等来评估两组儿童的认知、行为等发育水平。对3岁前接受手术麻醉儿童的神经认知功能（包括语言的学习和表达能力、认知、行为以及运动功能等）的检测显示，接受过单次麻醉暴露的儿童发生认知障碍的概率是对照组的2.4倍，多次麻醉暴露组的儿童发生认知障碍的概率是对照组的3.5倍[8]。Wilder等[9]对4岁以前接受全身麻醉的儿童进行了回顾性研究，结果发现与未接受过麻醉的儿童相比，接受过单次麻醉暴露的儿童并未表现出语言及数学的读写学习障碍，但接受过2次及以上麻醉暴露的儿童患学习障碍的风险明显增加；与此同时，暴露时长＞120 min的儿童患学习障碍的风险更高。上述研究表明幼年麻醉暴露频率及麻醉暴露时长与诱发学习障碍的风险存在正相关。Oba等[10]研究显示经受反复麻醉的儿童视觉诱发电位（visual evoked potential,VEP）参数明显改变，与Wilder等[9]的观点相符。

2 全麻药物与情绪、行为发育

2.2 临床研究情绪与行为的发育异常是神经毒性较为严重的后果之一，目前这方面的临床研究仍较缺乏。DiMaggio等[13]发现，3岁前接受腹股沟疝修补术的儿童，其行为发育异常的风险是对照组的2倍，发育和行为障碍的风险比对照组高60%[14]。对2岁前接受过重复麻醉的儿童行为发育量表的分析显示，麻醉暴露2次以上的儿童被诊断为注意力缺陷/多动障碍（attention deficit hyperactivity disorder,ADHD）的风险明显高于对照组[15]。Kalkman等[16]对6岁以前经历泌尿外科手术的儿童进行神经发育测评，结果发现2岁前接受手术麻醉的儿童神经发育异常的风险较高。儿科麻醉神经发育评估计划（the pediatric anesthesia neurodevelopment assessment,PANDA）与梅奥儿童安全（Mayo safety in kids,MASK）研究证实，3岁前多次麻醉暴露的儿童，神经心理学评估结果表现出明显的解决问题迟缓和精细运动协调能力下降，而这可能与行为发育间存在相关性[17]。全身麻醉与凋亡（general anesthesia and apoptosis,GAS）研究结果则表明，与清醒-区域神经阻滞麻醉相比，暴露时间短于1 h的全身麻醉并不会改变男性婴儿神经发育的结果[18]。这些研究提示，不必过于担心幼年时短期麻醉暴露对神经行为发育的影响，原因是测评量表的结果可能会受到当地的生活环境、经济发展、父母对儿童术后护理以及智力开发教育等诸多因素的影响，但幼年时期反复、多次、长时间的麻醉暴露可能是诱发神经发育障碍的高危因素之一。

3 全麻药物的神经毒性机制

利用动物模型可从神经元形态、神经递质传递、神经信号传导等多方面帮助探索全麻药物对未成熟大脑神经元分化、增殖和形成神经环路的干扰机制，这可为全麻药物对发育大脑的神经毒性反应的临床研究提供参考。

3.1 形态学改变神经元凋亡是全麻药物神经毒性的首要表现。大量研究表明，全麻药物诱导未成熟大脑神经元凋亡与认知发育障碍有关。但就数量而言，全麻药物诱导的神经元凋亡比例不到神经元总数的2%[19-20]，与细胞正常发育过程中50%的凋亡率相差甚远，提示细胞凋亡可能不是全麻药物神经毒性反应的唯一机制。一些治疗剂量的全麻药物如右旋美托咪啶等，可通过促进线粒体自噬抑制七氟烷诱导的海马神经元凋亡[21]。全麻药物长期暴露与短期暴露均可诱导细胞凋亡，但仅长期暴露下才会导致认知功能障[22]。幼年雄鼠和雌鼠暴露于异氟醚中，大脑各区域都出现了神经元凋亡，但仅雄性小鼠在物体识别实验中表现出记忆障碍[23]。因此，细胞凋亡与神经毒性之间是否存在必然联系仍有待商榷。超微结构下观察胞内细胞器变化发现，麻醉暴露后的神经元胞质中存在大量肿胀和/或退化的线粒体，提示线粒体融合和分裂异常。线粒体依赖途径由具有促凋亡（如Bax、Bid）和抗凋亡（如Bcl-2、Bcl-xL）作用的Bcl-2蛋白家族控制，两者的动态平衡维持线粒体膜的完整性。全麻药物引起促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白的比例增加（如Bax/Bcl-2），导致线粒体膜不稳定，出现渗漏、破裂，进而造成细胞色素c的渗出和细胞凋亡蛋白酶Caspase-3的激活。七氟醚可促进大鼠原代神经元内质网中钙离子（Ca2+）释放，使细胞内Ca2+浓度升高，线粒体摄取大量Ca2+后引起线粒体肿胀促使膜通道孔开放，并由此介导线粒体呼吸链功能障碍和ATP生成不足[24]。丙泊酚可剂量依赖性地抑制电子传递链复合物Ⅳ活动，降低线粒体膜电位和ATP含量，导致线粒体功能障碍和能量生产不足[25]。此外，全麻药物还可激活线粒体复合体Ⅳ、下调超氧化物歧化酶的清除率，使得活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基积聚，诱导线粒体裂变蛋白寡聚化后从细胞质进入线粒体，下调线粒体融合蛋白的活性，从而破坏线粒体裂变-融合的动态平衡，引起线粒体损伤[26]。

3.2 干扰突触功能研究证实，NMDA受体和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）受体信号通路可调节神经元增殖、分化和神经环路的形成。全麻药物被认为主要是通过抑制NMDA受体或激活GABA受体发挥临床作用[27]，且这一作用具有年龄依赖性[28]。因此推测全麻药物可能通过干扰突触发生、神经环路形成介导认知发育障碍。突触的形成和稳定是保证电化学神经递质正常传递的关键因素。P7大鼠接受混合全麻药物（异氟醚、氧化亚氮和咪达唑仑）暴露后，数小时内发生脑下脚区兴奋性和抑制性突触丢失[29-30]，与此同时突触前膜内神经递质囊泡入坞的比例显著降低[31]。但也有研究表明，使用全麻药物后海马齿状回神经元的树突棘密度显著增加[32]；在出生后2周内接受丙泊酚暴露内侧前额叶皮质锥体神经元树突棘密度降低，出生后2～4周内接受丙泊酚暴露则树突棘密度显著增加，且这些变化可持续到成年以后[33]。推测原因可能是全麻药物对突触发生的影响具有时间依赖性。突触可塑性指突触对活动模式的强化或弱化，涉及到不同信号蛋白的复杂调节，通常表现为突触效率的长时程降低（long-term depression,LTD）和长时程增加（long-term potentiation,LTP）。这些表现一般与Ca2+进入胞内产生去极化相关。LTP和LTD参与调节记忆巩固的过程，但在神经发育关键时期这一过程可被全麻药物阻断。研究人员连续3 d给P7大鼠腹腔注射20、40、60 mg/kg丙泊酚，24 h和72 h均观察到海马神经元的树突分支数、树突总长度和树突棘密度明显降低，60 d后大鼠海马LTP显著降低[3]。研究显示，低剂量异丙酚通过NMDA受体依赖机制促进LTD形成并损害LTP的维持[34]，而高剂量异丙酚则是通过GABAA受体抑制LTP，提示同种全麻药物不同剂量处理对海马突触可塑性的影响是不同的。依托咪酯也可通过调节海马锥体神经元上β2-GABAA受体的反馈抑制来降低LTP[35]。这种全麻药物诱导出的突触可塑性功能缺陷通常与后续行为中表现出的认知功能障碍一致[3]。

3.3 调节胞内信号转导通路信号转导通路具有极其规律的特性，其进化相当保守，对神经元的早期发育和生存至关重要。全麻药物参与调控多种神经元胞内相关分子的表达。研究发现，氯胺酮通过抑制成熟脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）的表达使得未成熟的BDNF前体与低亲和力的神经营养因子受体p75NTR结合，诱导下游肌动蛋白解聚，导致突触丢失和细胞死亡[30，36]。BDNF还可引起磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase,PI3K）/丝氨酸苏氨酸特异性蛋白激酶（protein kinase,PKB，又称Akt）和蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）/细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase,ERK）等主要激酶通路的磷酸化和激活。磷酸化的Akt诱导下游蛋白糖原合成酶激酶（glycogen synthase kinase,GSK）-3β磷酸化，导致GSK-3β失活，诱发下游未知机制引起细胞凋亡。磷酸化的ERK则迁移到细胞核，诱导与生存相关的基因转录（cyclin D1,c-Fos），并抑制细胞周期抑制剂的表达[37]。

Toll样受体家族（Toll-like receptors,TLRs）存在于多种微生物表面或细胞内，通过刺激机体的固有免疫发展获得性免疫。TLR4是哺乳动物中TLRs同源性最高的蛋白，通过髓系分化因子88（myeloid diferentiation factor 88,MyD88）/NF-κB通路调控神经干细胞的自体更新，具有抑制神经元细胞增殖和分化的作用。TLRs通过NF-κB信号通路在神经元干细胞中发挥特异性作用。七氟烷则是通过激活TLR4，促进TLR4/MyD88/NF-κB信号转导通路，触发下游信号转导，从而导致一系列炎症因子如IL、TNF等的表达，并因此干扰神经元分化与增殖[38]。

3.4 诱发炎症反应全麻药物作用下，促炎性细胞因子、IL、TNF等表达上调[39-40]。研究发现，幼年时遭受麻醉暴露的大鼠，成年后脑组织中IL-6、TNF-a、CC趋化因子配体（CC chemokine ligand,CCL）5和巨噬细胞炎症蛋白（macrophage inflammatory protein,MIP/CCL3）表达增加，说明幼年麻醉暴露诱发的神经炎症可长期存在[41]。促炎性细胞因子通过神经元凋亡、线粒体和氧化损伤以及神经元分支受损等多种机制影响神经元功能，炎症与焦虑、抑郁等多种神经精神障碍密切相关[42]。幼鼠接受全麻药物前预防应用抗炎性甾体类药物可明显改善全麻药物诱导出的认知及行为改变[41]，进一步说明炎症可能是全麻药物对未成熟大脑神经毒性的作用靶点之一。

3.5 调控神经胶质细胞大脑中还存在着10倍数量于神经元的神经胶质细胞，主要包括星形胶质细胞、少突胶质细胞（两者合称为大胶质细胞）和小胶质细胞等。星形胶质细胞数量最多，通过调节神经元迁移、成熟和突触塑造（如突触数量、功能和稳定性）等多方位调控大脑发育。缺乏星形胶质细胞共培养的神经元不仅突触密度会降低，现有突触的自发活动也明显减少。离体实验发现，异氟醚可延迟未成熟星形胶质细胞的形态分化并损害其生长[43]。在体实验结果也表明，七氟醚可使新生大鼠的星形胶质细胞数量明显下降[44]。少突胶质细胞是中枢神经系统中包绕轴突形成髓鞘的结构，促使轴突髓鞘化，使生物电信号跳跃式传递，从而协助神经信息高效传导。丙泊酚可导致新生小鼠少突胶质细胞增殖受限，明显增加凋亡细胞数量[45]。小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞，是神经炎症的驱动因子，是神经退行性疾病中认知障碍的基础神经机制。它通过清除死亡神经元，修剪无功能的突触，并产生支持神经元存活的配体来帮助调节大脑功能。研究表明，3%七氟醚连续3 d暴露2 h/d，可激活未发育成熟小鼠的小胶质细胞并通过NF-κB通路诱发下游神经炎症反应。此外，七氟醚还参与调节发育小鼠海马中的小胶质细胞表型，上调M1和M2b表型的表达，下调M2a表型的表达，其中前两者分别与促炎性状态、免疫调节相关，而后者与组织修复及吞噬作用相关[46]，进一步支持全麻药物诱发了炎症反应。胶质细胞发育异常或功能障碍会严重干扰神经元生长及神经环路的形成，目前关于全麻药物对神经胶质细胞的毒性研究较少，且相关研究多局限于某一具体时间点的观察。后续研究可围绕全麻药物对神经胶质细胞毒性的易感性、时间窗及持续时长等展开探讨。

3.6 表观遗传学修饰表观遗传学认为，在细胞核DNA序列没有改变的情况下，基因功能可发生可逆的、可遗传的改变，如DNA甲基化修饰、组蛋白修饰和非编码RNA等，这些改变是机体对环境刺激因素变化的反映，这些改变相互作用可调节基因表达、控制细胞表型、维持机体内环境稳定，有助于正常生理功能的发挥。已有研究表明，氧化亚氮、咪达唑仑和异氟醚混合物可造成环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein,CBP）断裂[47]。CBP含有组蛋白乙酰转移酶活性，在遭受麻醉暴露后可间接导致组蛋白3乙酰化降低，引起BDNF和c-Fos转录下调，干扰记忆的形成与巩固。胞嘧啶C5的甲基化会使得基因难以被转录因子接近，因此甲基化状态具有稳定性和可遗传性。大脑中DNA甲基化的降低与随着年龄增长而出现的学习和记忆功能下降一致。P7大鼠暴露于七氟醚中6 h可引起脑下脚区神经元胞嘧啶C5甲基降低，表明全麻药物降低DNA甲基化，并且这种低甲基化模式会遗传给从未被麻醉的后代[48]，初步解释了母体接受麻醉后其后代表现出形态和认知缺陷的现象。表观遗传学修饰涉及的蛋白家族成员较多，因此各类修饰的具体信号通路仍需要细化研究。

4 潜在的保护性机制

麻醉暴露时采取相应的保护性措施可减轻全麻药物引起的认知障碍。例如，线粒体损伤及其介导的神经元凋亡可被L型Ca2+通道拮抗剂尼莫地平缓解[24]。锂可通过减弱全麻药物诱发的ERK磷酸化来发挥抗神经细胞凋亡作用[49]。作为具有抗氧化功能的内源性激素，褪黑素可通过激活蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）α/转录因子NF-E2相关因子2（nuclear erythroid 2-related factor 2,Nrf2）信号通路拮抗全麻药物引起的氧化应激，发挥神经保护作用[50]。溶质载体家族蛋白中钠钾氯共转运蛋白1（Na+-K+-2Cl-cotransporter,NKCC1）和钾氯共转运蛋白2（K+-2Cl-cotransporter,KCC2）的相对表达水平与氯离子流入或流出细胞有关，前者使细胞膜超极化，后者使细胞膜去极化。雄激素受体拮抗剂可通过阻断NKCC1的功能促使细胞由抑制性向兴奋性转变，进而降低未成熟大脑对全麻药物神经毒性的易感性[51]。RhoA是一种小的鸟苷三磷酸酶，能够解聚肌动蛋白。异氟醚可引起RhoA活化、细胞骨架解聚和诱发细胞凋亡。p75神经营养因子抑制剂能够通过抑制RhoA活化阻止下游肌动蛋白解聚，从而显著减轻未成熟大脑中全麻药物介导的神经毒性[52]。白藜芦醇是一种天然的多酚类物质，具有抗炎活性。白藜芦醇预处理可逆转七氟醚诱导的M1/M2小胶质细胞比例失衡，改善七氟醚诱导的发育中小鼠认知功能障碍[46]。麻醉前预防性应用甾体物质黄体酮能够明显改善炎症反应和全麻药物诱导出的认知及行为改变[41,53]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂如恩替诺他则可有效逆转全麻药物诱导出的H3组蛋白低乙酰化[54]。除了药物干预，锻炼也被证明能够增加H3和H4的乙酰化、提高海马体中的c-Fos和CBP的表达，改善全麻后大鼠的记忆[55]。亚低温（35.0～36.5℃）可显著减少七氟醚在未成熟大脑灰质和白质中诱发的神经元和少突胶质细胞的凋亡，对凋亡性脑损伤具有显著的保护作用[56]。后续研究可就类似的非药物方法展开深入讨论。

5 小结

动物研究和临床研究都警示早期、反复、多次、长时间全麻药物暴露，对未成熟大脑可能有一定的神经毒性反应，全麻药物造成的神经形态改变对神经发育的影响深远。目前还很难将实验室的研究与临床实际操作相结合，当实验室研究向临床转化时，还存在很多本质问题及不确定性，如无法确定人类精确的易受损时间窗、引起神经受损的药物剂量的上限、临床上无法排除的如手术疾病等混杂因素。使用动物模型从神经环路、分子机制等多种角度阐明全麻药物神经毒性的作用靶点并找出干预措施为探索转化临床应用提供了可能。

相比动物，人类发育时期更长、得到的麻醉护理更好，恢复能力也更优。全麻药物在减轻疼痛等刺激对神经发育的影响中起到一定的神经保护作用。因此麻醉医生应合理正视、权衡全麻药物对未成熟大脑的保护作用与毒性反应，选择更为合理的临床用药及麻醉方案，如尽量延迟对生长发育无影响的择期手术的时期、复合选用合适的区域阻滞技术减少全身麻醉用药的剂量、精准麻醉减少血流动力学波动、合理镇痛发挥麻醉药的保护性作用等。