腐乳制作过程品质影响因素研究进展

张智鑫，汤娇娇，王远亮，2，尹兰凤，李 珂，2

（1.湖南农业大学 食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；3.湖南省永光食品股份有限公司，湖南 株洲 412413）

0 引言

腐乳作为一种发酵豆制品，距今已有1 000 多年的历史[1]。腐乳分类方式很多，根据制作方式不同可以分为腌制型与发酵型，其中发酵型腐乳又可根据不同菌种发酵分为毛霉发酵、根霉发酵及细菌发酵[2-3]，安徽八公山腐乳和黑龙江克东腐乳就是典型的细菌发酵腐乳[4-5]；根据制作辅料的不同，可分为红腐乳、白腐乳和青腐乳[6]。腐乳生产工艺主要有制胚、接种、前发酵、添加辅料、后发酵等[7-8]。其中，微生物接种、腌制（前发酵） 和添加含醇调味料是工艺的核心步骤[9]。

传统腐乳制作工艺流程：

大豆→浸泡→磨、煮→点卤→蹲脑→压块→切割→冷却→接种→前发酵→加辅料→后发酵→成品。

腐乳的主要原料——大豆，具有丰富的营养价值，其营养价值包括降血糖、降血脂、预防癌症、提升大脑神经机能等[10-11]。而经过发酵的腐乳含有丰富的蛋白质、人体必需氨基酸[12]、维B2、维B12、大豆异黄酮等营养成分[13-14]。目前，大部分腐乳生产还沿用传统发酵方法，导致发酵过程中存在发酵菌种有效筛选不足、腐乳含盐量偏高等缺陷，这将直接导致腐乳营养成分流失，降低腐乳的品质，影响人体健康。近年来，腐乳作为热门研究领域颇受关注。有研究表明，腐乳具有良好的降胆固醇、降血压及抗氧化作用[15]。从腐乳制作过程出发，详细阐述各个环节中可能存在对腐乳品质造成影响的因素，并提出相应解决方法，为腐乳企业的工艺改进和消费者食用安全性提供理论依据[16]。

1 制胚

大豆作为制作腐乳的源头材料，其安全性尤为重要，有研究表明大豆会给腐乳的生产带来安全隐患，如农药残留、细菌污染、黄曲霉毒素污染等，这些都是可能影响腐乳品质的重要因素。廖新浴等人[17]在对腐乳的检测时发现，腐乳中含有蜡样芽胞杆菌（Bacilluscereus）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumanii）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis） 等食源性致病菌，这说明腐乳的品质问题不单单要从生产过程中抓起，更要保证源头的质量安全。选择好的大豆，从源头对腐乳的品质进行把控，同时采用不同品种的大豆进行发酵也会对腐乳品质造成影响。穆德伦等人[18]将9 种常用大豆品种作为原料，采用相同的制作工艺生产腐乳，通过气相色谱-质谱联用、质构仪、电子舌及常规理化检测，对9 种不同大豆做出的腐乳进行检测，结果发现大豆及腐乳之间的指标存在相关性，而不同大豆生产出的腐乳在风味物质及理化指标上存在一定差异：不同品种大豆加工的腐乳产品b* 相差较大，相对标准偏差达到-50.54%；质构方面，硬度差异达到66.57%，咀嚼性差异达到55.27%，黏性差异达到49.30%；滋味特征方面也存在一定差异。周雪琪等人[19]针对不同黄豆品种发酵腐乳进行比较发现，在相同发酵条件下，采用大黄豆发酵腐乳0.741±0.047 g/100 g 中的氨基酸态氮含量显著高于小黄豆发酵腐乳0.523±0.097 g/100 g，且硬度较为松软，弹性较好，具有更完整三维网络结构。由此可见，原材料的选择在一定程度上可以影响成品的最终质量。大豆的选取一方面可以保证腐乳成品在食用安全上得到保证；另一方面，口感的提升也与其息息相关。在选取大豆时，厂家应该严格把控大豆质量，从而提升产品品质。

2 微生物接种

将切块后的豆腐进行摆盘，此时大小相同的小块豆腐称之为白胚，腐乳白胚通过接种微生物形成毛胚。在该变化过程中，接种的微生物产生各种酶，对大豆蛋白进行分解，大豆蛋白不断减少，游离氨基酸、脂肪酸含量不断增加；且由于化学成分的变化，毛胚相较于白胚的硬度、黏度等质构指标也相应地发生改变。微生物接种作为腐乳生产过程中重要步骤，对腐乳的营养健康及口感均有影响。

2.1 接种方式

腐乳在制作过程中的接种方式有自然接种和人工接种，传统接种方式为自然接种，该方法只需将腐乳白胚放置在发酵房中，环境中的微生物落在白胚上，逐渐生长后形成腐乳毛胚；人工接种需人为地将菌种洒在腐乳白胚上，而后生长为腐乳毛胚。目前，腐乳企业微生物接种多采用人工方式，此方式能够保证发酵菌种较纯，但由于环境及原料中其他菌株参与，可能是导致腐乳微生物多样性的原因之一。汪红梅等人[20]对自然发酵腐乳与人工发酵腐乳中的微生物进行对比研究，发现二者中的微生物数量和种类相差较大，自然发酵腐乳中菌落总数为8 600 CFU/g，而人工发酵腐乳中菌落总数为310 CFU/g，同时在致病菌的检测中，自然发酵腐乳中发现了对人体有害的致病菌，包括沙门氏菌（Salmonella）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus） 及金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。李娜等人[21]使用变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE） 技术结合高通量测序对湖北恩施自然发酵腐乳中的微生物进行研究分析，发现假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter） 及鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium） 等5 种菌属为优势菌属。Xie Chunzhi 等人[22]通过对比试验表明，细菌接种发酵及霉菌接种发酵腐乳优势菌属具有显著差异，细菌接种发酵腐乳中棒状菌属（Corynebacterium）、 乳 杆 菌 属 （Lactibacillus）、 红 曲 霉 属（Monascus） 为优势菌属；霉菌接种发酵腐乳中乳球菌属、短杆菌属（Brevibacterium）、假丝酵母属（Candida） 及毛霉菌属（Mucor） 为优势菌属。在人工发酵腐乳生产中，虽使用的是纯菌种，但是在整个生产过程中，生产机器及环境都不能保证可以完全隔离杂菌；制作腐乳所用盐浓度也不能完全抑制杂菌，杂菌的生长会破坏腐乳的营养物质，甚至产生有毒有害物质、产生气体，影响腐乳的发酵与保存[23]。这说明自然发酵腐乳和人工接种发酵腐乳中微生物资源丰富且具有多样性，但相较于人工发酵腐乳，自然发酵腐乳在菌种的种类及数目上难以保证，有毒有害微生物的生长得不到控制，因此自然发酵腐乳在保藏及食用安全方面存在着较大的问题。

2.2 菌种选择

毛霉在发酵过程中产生丰富蛋白酶，可以更好地分解蛋白质，所得到的腐乳具有较好的品质。但由于毛霉对生长条件具有较高需求，适宜生长条件为15～18 ℃，夏天不利于毛霉的生长，导致生产周期严重受限；根霉产蛋白酶的能力稍逊于毛霉，但根霉能产生较多的脂肪酶和糖苷酶，且耐高温，在30～40 ℃的条件下能够正常生长，Han B Z 等人[24]提出少孢根霉具有活力高、生长快的特点，可以明显缩短腐乳生产周期，且不断产生大量蛋白酶、脂肪酶等使游离氨基酸、游离脂肪酸含量增加，其中产生的β -葡萄糖甘酶更具有使大豆异黄酮转化为抗菌、抗氧化、抗癌能力强的异黄酮甙元能力；细菌型腐乳在生长发酵时，可以产生大量酶、赖氨酸及谷氨酸，提高腐乳鲜味及口感，但细菌型腐乳的成型能力较差，未得到大规模使用[25]。

Wenjing Bao 等人[26]试验表明，腐乳中添加短乳杆菌（Lactobacillus brevis），能够增加γ -氨基丁酸浓度及挥发性风味物质含量，降低组胺和血清素浓度，提高腐乳在食用方面的功能性和安全性。Huang X N 等人[27]表明腐乳生产过程中感染到的杂菌，会对腐乳的最终品质产生影响，其中假单胞菌属与组胺和尸胺等对人体健康有害的生物胺具有相关性，产生不良气味，造成腐乳品质败坏。崔晓红等人[28]针对不同菌种处理对腐乳品质的影响做出研究，分别制作了接种包括单一菌种和混合菌种的5 种样本作为比较，研究样本之间的理化性质及感官差异，发现雅致放射毛霉与少根根霉混菌发酵所得腐乳香气纯正，口感鲜美细腻，软硬适度。李顺等人[4]通过对八公山豆腐进行总状毛霉和米根霉接种发酵进行对比，发现二者发酵时间及温度具有不一致性，但是在蛋白酶活力、脂肪酶活力及氨基酸总量方面各具优势。同时，该研究团队还指出，使用总状毛霉和米根霉（1∶1） 在28 ℃下混菌发酵56 h，得到蛋白酶活力为50.51 U/mL，糖化酶活力为15.15 U/mL，在一定程度上弥补了单一菌种发酵综合酶活力较低的不足，具有菌丝密度和粗壮性更好、产孢子量少的优点[29-30]。

菌种是影响腐乳中营养物质含量、风味口感的重要因素，试验证明采用混合菌种发酵腐乳更有利于营养价值提升。但想要探寻更好的微生物发酵方式，还需要经过不断的试验，探寻更合适的菌种类型及混合比例。人工接种的毛霉和根霉作为优势菌在一定盐浓度下可以抑制杂菌的生长，但是在生产中各个环节仍要杜绝杂菌的侵入，减少杂菌对腐乳的破坏，保证腐乳的正常发酵与保藏，降低有害物质对人体的危害。通过对于文献的整合，虽不能找出一个确定的混合菌种种类与数目，但可以确定的是，混合菌种发酵将是未来腐乳生产的趋势。

3 食盐

食盐作为日常生活中最常见的调味品，在腐乳中能够形成咸香口感，提高鲜度，使腐乳块收缩变硬，防止贮藏时间过久发生酥烂，以及在后酵过程中抑制酶催化蛋白质分解，防止霉菌生长，起到延长保质期的作用[31]。在探究食盐对腐乳中大豆异黄酮含量影响变化试验中，周荧[32]设置低浓度食盐腐乳（含盐量10%） 和传统发酵腐乳（含盐量15%） 2 组对照试验，针对食盐对腐乳中的化学指标（如大豆异黄酮的含量、蛋白质、游离氨基酸、脂肪等） 和物理质构参数（如硬度、黏着性、弹性） 的影响结果表明，含盐量为10%的腐乳所含有的化学营养成分显著高于传统发酵腐乳，主要原因是在含盐量较高的环境下，食盐对酶伤害较大，传统腐乳中的酶活性低于低盐腐乳中的酶活性，同时间内腐乳中的营养物质不能被完全分解；在物理质构方面，除硬度随发酵时间的延长先升高后降低，黏着性逐渐升高，弹性逐渐降低，说明盐浓度不会改变腐乳物理质构方面的变化趋势，且低盐腐乳的成熟时间较传统腐乳的样品短。马勇等人[33]在对腐乳的研究中也得到了相同的结论。蒋芳芳[34]针对盐分对腐乳化学成分的影响进行研究，通过对含盐量8%和含盐量10%的腐乳检测其氨基酸含量（必需氨基酸、呈味氨基酸、疏水氨基酸）、挥发性成分及抗氧化肽活性，结果表明，低浓度含盐量腐乳能够发生盐溶作用促使腐乳中蛋白质分解，因此含盐量为8%的腐乳中各类氨基酸含量显著高于含盐量为10%的腐乳；挥发性成分也有较大的差距，在发酵前期，含盐量8%的腐乳挥发性物质含量较多，而随着发酵时间延长，含盐量10%的腐乳挥发性物质变多；抗氧化肽试验中，抗氧化能力大小呈现先升高后降低的趋势，盐度较低抗氧化能力较强。张晓峰等人[35]对腐乳的抗氧化和ACE 抑制活性进行研究，针对2 种盐浓度（6%和10%） 的腐乳进行对比，研究发现，在发酵过程中二者的自由基清除能力都是先上升、后下降，转折点在发酵30 d 左右，但是在整个过程中含盐量为6%的腐乳呈现出来的自由基清除能力都比含盐量10%的腐乳要好；ACE 抑制活性的研究中，含盐量为6%的腐乳在发酵的大部分时间里优于含盐量10%腐乳[36-37]，基于以上2 组数据表明，低盐腐乳在自由基清除能力及ACE 抑制活性明显优于高盐腐乳。

腐乳中的生物胺对人体有一定的危害[38]。Fan Xuejing 等人[39]对腐乳的研究中指出，高浓度的食盐会使腐乳的发酵过程延长。结果表明，使用微波杀菌在保证克东高盐腐乳风味、质构等方面变化不大的情况下，可以减少食盐用量及发酵时间，而且该方法生产的腐乳中总生物胺含量降低了46%，这对于腐乳的制作工艺发展是一个很大的进步。李娟[40]通过在腐乳中加入凝胶剂CaSO4和MgCl2置换氢离子形成桥联作用，后酵过程中加入料酒、辛香料及甜味剂来制造香气，同时乙醇能达到杀菌、防腐和抑制酶活的作用，从而降低食盐使用量。

综上可以得出结论，含盐量相对低的腐乳比含盐量相对高的腐乳在营养物质含量及质构方面较好。但对于腐乳的食盐含量范围，行业规定其含量在6.5%以上（SB/T 10170—2007），不仅仅是因为含盐量会影响到保质期和酶活性，更是由于盐分含量关系到生物胺的控制[41]。因此，在具体生产的过程中，要考虑到盐分对于风味物质的呈现及保质期和安全性等多方面因素的影响。食盐是食品行业不可或缺的一味香辛料，但由于食用过多会对人体有一定伤害，因此研究人员一直致力于通过一些其他的手段代替食品中部分食盐的作用。腐乳中食盐既起到了滋味的贡献作用，又起到了防腐、抑制蜡样芽孢杆菌和生物胺的作用。因此，通过微波、高压高温等一定手段延长腐乳的保质期，就可以减少腐乳中的食盐用量，在保证保质期的同时不会损坏腐乳的最终品质。

4 发酵条件

腐乳发酵经过2 个阶段，前发酵和后发酵。腐乳白胚通过接种微生物，进而变成毛胚的过程称之为腐乳的前发酵，前发酵过程中大豆蛋白、游离氨基酸、脂肪酸及物理质构方面都会发生一系列变化；后发酵发生在辅料的添加后，此过程腐乳的各方面理化性质趋于稳定，风味物质的种类和数量逐渐增加。蒋丽婷等人[42]对4 种不同品牌白腐乳进行研究，发现4 种腐乳风味由于辅料、发酵条件等不同，游离氨基酸等呈味物质及酯类、醇类等挥发性风味物质含量、种类有显著差异。另有研究表明，腐乳在发酵过程中，随着发酵时间的延长，在后发酵期间经一系列复杂的发酵代谢和生化反应形成了大量的风味化合物，使得风味物质也会有所改变[43]。何熙等人[44]通过高压电场对瓶装腐乳进行处理发现，高压电场会影响腐乳中蛋白酶的活性，进而影响腐乳后发酵所需时间，当酶活性较强时，后发酵时间会缩短。

李金红等人[45]对腐乳生产工艺的研究中，指出腐乳在前发酵时的接种方法为三面接种法，该方法是将菌种与面粉混合后撒在豆腐胚上，且对于发酵房的消毒是使用甲醛或者硫磺。而尚丽娟[46]则提出腐乳进行前发酵时，将菌种制成悬浊液，然后喷至腐乳胚。由此可以看出，随着时间的增加，腐乳的制作工艺有所提升，菌种与豆腐胚并不能充分混合，所以在制作过程中并不能保证腐乳胚的每一面都可以接受到相同数量的菌种，这就导致豆腐胚的发酵不均匀，而菌悬液就可以避免这种情况，发酵厂房也更安全。

腐乳的制作过程中，发酵温度的不同，会对腐乳抗氧化能力产生一定的影响[47]。有研究发现，大豆中异黄酮含量变化主要发生在发酵成熟期间，其变化与发酵温度有密切关系。例如，Lee I-Hsin 等人[48]研究表明发酵蒸煮黑豆在30 ℃下糖苷元含量增加最大，其次是37 ℃和25 ℃。Huang Y H[49]通过试验表明45 ℃的发酵温度能够产生更多具有生物活性的异黄酮，另外该研究人员也发现45 ℃发酵温度的腐乳提取物对Fe2+螯合能力及DPPH 自由基清除能力可以达到最强，而25 ℃下DPPH 自由基清除能力较低，但也比未经发酵豆腐高得多[50-51]，从而判断较高的发酵温度会提高腐乳的抗氧化能力。

5 其他影响

腐乳发酵过程中会产生许多白点，且其他发酵食品中也会有白点出现。白点的出现虽不会产生安全问题，但消费者从感官上难以接受。多年来，许多研究人员通过试验对腐乳中的白点进行分析，先后得出白点为草酸钙、石膏等结论，直到20 世纪90年代有人对腐乳中的白色结晶进行了化学试验分析，通过燃烧判定白色结晶为有机物，通过酸碱反应和显色反应，初步判定白色结晶为酪氨酸，后面根据Folin 酚法和图谱分析，判定其为游离的酪氨酸[52]。随着检测技术的不断提升，对于白点的认识也不断加深，现如今国内外对于豆制品中白色结晶成分组成一致认为是酪氨酸及少量苯丙氨酸，关于白色结晶的形成机制，推测为蛋白质大量分解，产生了过量酪氨酸，进而形成结晶[53]。Kröckel L 等人[54]用显微镜分析发现腌制牛肉肠中白点物质主要成分是酪氨酸和苯丙氨酸。侧面印证了腐乳中白点的构成。针对这一现象，许多科研人眼进行研究，提出解决办法。杨熙等人[53]提出控制制曲条件：控制毛霉生长、驯化菌种：通过13-15 代培养找到具有低活性蛋白水解酶的发酵菌株、优化生产工艺：包括温度、盐度、发酵时间等方法，通过此类方式，可以减少腐乳中蛋白酶的积累，从而降低酪氨酸的产生，进而明显减少腐乳中白点的出现。江景泉等人[55]同样指出，除了以上几个方法可以抑制白点的生长，改变pH 值，将其控制在pH 值小于5.66 的环境下，有利于酪氨酸的分解，同样可以减少此类情况的发生。白点虽不会对腐乳的食用产生安全问题，但会影响消费者的购买欲望，通过以上方式的解决，会大大减少此类问题的发生。

生物胺的前体物质是氨基酸，故存在于许多富含蛋白质的食物中[56-57]。腐胺、尸胺、组胺和色胺是腐乳中主要和常见的生物胺种类，灰色腐乳中腐胺、尸胺、色胺、β -苯乙胺和酪胺的含量均显著高于白色和红色腐乳[58]。除食盐可以抑制生物胺在腐乳中的含量外，许多研究人员根据生物胺形成的条件，提出可以通过以下途径控制生物胺的含量：控制食品中游离氨基酸的含量，控制产生氨基酸脱羧酶的微生物的生长，控制氨基酸脱羧酶的活性，增强生物胺的降解水平[59]。此外，控制发酵过程中的pH 值、添加适量乙醇也可以较好地控制腐乳中生物胺的含量[60-61]。

此外，腐乳接种的微生物分解大豆蛋白产生各种酶会影响腐乳的营养及风味物质[62-63]。潘进权等人[64]认为腐乳中不具有大豆蛋白分解后的苦味，原因在于腐乳发酵过程中毛霉产生的蛋白酶起到了一定作用。张媛媛等人[65]通过在腐乳中添加酶，促使腐乳快速发酵，在保持安全性与风味的同时缩短制作时间，在试验中通过添加LL-50 及酶制剂的手段发酵腐乳，并且与传统发酵的红方腐乳做对比，发现二者的电镜、电泳、红外光谱分析结果差异性不大。这一结论与任健等人[66]研究结果表明的添加木瓜蛋白酶可缩短腐乳后酵时间，腐乳硬度较好且体形完整相符合。符晓静等人[67]从营养角度分析，毛霉发酵中加入外源蛋白酶、根霉发酵中加入外源淀粉酶更有利于其营养价值的提高。研究人员通过试验探究不同因素对腐乳中酶数量及活性影响，能够有效提升腐乳的发酵时间及发酵品质。未来，根据不同的生产条件和生产需求添加额外的蛋白酶，加快腐乳的整体发酵时间、改善腐乳的口感、增加腐乳的风味，或许会成为一种可行的方案。

6 结语

腐乳在我国深受广大人民的喜爱，但是腐乳的品质问题始终得不到保证，其最终品质受到许多因素的影响。大豆的选择既会影响最终的安全性，又因其蛋白质的不同，导致后面一系列有关于蛋白质分解导致的差异，包括质构、风味、口感等方面。菌种的使用关系到蛋白质分解的程度、酶的活性，以及最终风味的差异。蛋白酶的额外添加可以减少发酵时间。食盐的添加，一方面起到滋味的贡献；另一方面防腐、蜡样芽孢杆菌的杀灭、生物胺的控制，都少不了食盐的作用，但过多的食盐摄入也会产生一定的影响。辅料的使用直接关系到腐乳的风味。发酵条件的控制可以减少白点的产生、减少杂菌的污染、改善腐乳的风味物质，进而提升腐乳的最终品质。生物胺的减少，需要从各个环节上进行监控，进而保证其含量的减少。

根据影响腐乳最终品质的这些因素，通过总结概括大量试验，最终提出从源头的大豆选择、菌种的混合发酵、酶的添加、食盐含量的控制与多种方法混合使用延长保质期、理化指标的分析及制作过程中的一些改进方案。希望通过以上概述总结，可以使腐乳在今后生产加工中，得到安全与品质的双层提升。