猪戊型肝炎的诊断技术研究

谢春芳 周佳明 于瑞嵩 董世娟 陈冰清 李震*

（1上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海 201106；3上海市金山区动物疫病预防控制中心，上海 201500）

戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus，HEV）是引起急性肝炎的病原之一，在全球范围内广泛传播流行，其宿主范围众多，可在人类、家畜、家禽、宠物和各种野生动物中感染并跨种传播、蔓延扩散，易造成戊型肝炎的爆发和散发[1]。其中，人源和猪源的HEV的基因同源性较高，故HEV可在人群和猪群中自由传播而不受物种屏障制约[2-5]。

我国是猪戊型肝炎和人戊型肝炎的高发流行区，例如，在新疆南部爆发的一次猪戊型肝炎，导致当地猪戊型肝炎抗体阳性率高达80%以上，致使700多人死亡、12万人感染[6-7]。因此，清除猪戊型肝炎，对于我国维持一个健康安全的养殖环境和人畜和谐相处的公共环境是非常关键和必要的。但是，如何建立一个兼具特异性、敏感性和稳定性的猪HEV检测诊断方法，目前还没有一个比较统一的标准，且如何区分猪戊型肝炎是急性还是慢性，对净化猪场HEV有非常重要的意义。感染急性戊型肝炎的普通猪大概率可以自愈，并可清除自身体内的HEV；而感染慢性戊型肝炎的病猪则不同，由于病猪的免疫能力受损，HEV会长期存在于病猪体内，无法被完全清除，从而成为一个长期的传染源。在此背景下，笔者通过查阅相关文献，拟对猪戊型肝炎的临床症状、实验室检测方法、诊断及评估方法等进行总结介绍，以期为建立一个准确快速的猪戊型肝炎检测诊断标准提供理论依据。

1 猪戊型肝炎的临床症状

猪感染戊型肝炎的临床症状与人感染戊型肝炎的临床症状类似，但是，普通猪感染HEV后通常不表现出典型的临床症状。其中，急性戊型肝炎病猪表现出发烧、腹泻、黄疸、病毒血症，肝组织表现出局灶性或散在性坏死，肝细胞变性，肝小叶中央静脉淤血，肝小叶间或肝小叶内淋巴细胞浸润等；免疫功能低下或合并感染其他病毒的病猪，还会出现慢性HEV感染和肝外疾病，且肝组织会纤维化，最终发展为肝硬化和急性重度肝衰竭[8-10]。

值得注意的是，猪HEV与其他肝炎病毒共同感染引起的病猪临床症状有的与猪急性戊型肝炎相似，故病猪的临床症状只能作为参考，不能作为诊断依据，要准确判断猪戊型肝炎还需依靠实验室检测。

2 猪HEV的实验室检测

2.1 猪HEV抗体检测

目前，酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）因检测方法简单、灵敏、特异性强，可检测血清或体液分泌物中许多病毒的抗原抗体，而被广泛应用于血清学诊断研究。因此，ELISA是猪HEV抗体检测的标准方法，也是主要方法之一，可分别检测猪HEV特异性的中和抗体（主要是HEV-IgM和HEV-IgG）。一般来说，猪HEV ELISA抗体检测试剂盒一天可检测几百份样品，可迅速判断被检样品中猪HEV-Ig G或猪HEV-IgM的检测结果[11]。

其他可以用于检测猪HEV抗体的方法还有免疫荧光检测法（immunofluorescence assay, IFA）、免疫色谱分析法（又称免疫亲和层析技术，immunoaffinity chromatography）和高通量中和分析（high-throughput neutralization assay）。其中，高通量中和分析具有检测快捷和结果准确的优势，但因其所需仪器价格比较昂贵，目前在国内外并没得到广泛应用，在未来若仪器改进、价格下降，此方法将具有广阔的发展前景[12]。

2.2 猪HEV病原检测

既灵敏又准确地检测猪HEV病原的方法就是检测其病毒核酸RNA，其中，RT-PCR是常用且可靠的病毒核酸RNA检测方法，既可用以检测猪血清或粪便样品中有无猪HEV核酸RNA，又可定性和定量分析，更可检测出较低的猪H E V核酸RNA浓度（低至7 IU/mL）。一般来说，扩增引物通常选择在猪HEV的ORF2基因保守区域，基因扩增采用巢式PCR，设计内外二对扩增引物，以提高检测灵敏度[13-16]。检测到猪HEV核酸RNA后，对结果为阳性的样品，还需对扩增序列进行测序比对，以进一步验证确认是否为猪HEV核酸RNA序列，且得到的基因序列还可进行基因分析，以追溯基因的起源及遗传分化（HEV分为8个基因型，至少有36个基因亚型，这些不同基因型之间的差异原由、相互之间的交叉感染机理等，均有待进一步研究探索[17-18]）。

其他可用于检测猪HEV病原的方法还有高通量分子测序技术、全自动核酸检测系统、猪HEV抗体片段包的ELISA法、免疫印迹分析（Western blotting）和电镜分析。其中，高通量分子测序技术是一种深度测序方法，对全基因组的测序能保留最原始的特性，具有高准确性、高灵敏度的优势；全自动核酸检测系统能自动完成从样本处理到扩增、检测的一系列操作步骤，可用于特定HEV核酸分子的检测与分析[19]，但目前此方法还没有被广泛应用。

2.3 猪ALT水平检测

丙氨酸转氨酶（alanine transaminase，ALT）是检测肝功能的重要指标之一。健康猪的ALT水平在（33±3）U/L，猪感染HEV后血清中的ALT水平会略微升高，故ALT水平可作为猪HEV的辅助检测项目，也可作为肝功能的相关指标与流行病学史等一起用于综合诊断[20-21]。

2.4 猪HEV实验室检测的注意事项

具体为：（1）避免猪HEV感染潜伏期的漏诊。猪HEV感染潜伏期漏诊是造成猪HEV检测结果为假阴性的主要原因之一，故需开展周期性的重复检测。（2）需对猪HEV核酸RNA进行测序分型。HEV只有1个血清型，但有8个基因型和许多亚基因型，不同动物对不同基因型HEV的易感性有所差别，故对猪H E V核酸R N A进行测序分型，有利于进行HEV的感染溯源追踪和病毒演变分化研究。

3 猪戊型肝炎的诊断及评估

3.1 猪急性、慢性戊型肝炎的诊断

可通过RT-PCR检测猪HEV核酸RNA，并结合猪HEVIgM和IgG抗体水平进行综合判定。

在实验室条件下，猪感染HEV后，最早于感染0.5周后在血液和粪便样品中可检测到猪HEV核酸RNA，于感染2周后在粪便中可检测到猪HEV核酸RNA，于感染4周后在血清中可检测到猪HEV核酸RNA，且感染3～6周后病原消失，故能检测到猪HEV核酸RNA的主要为4月龄以下的猪，6月龄以上的猪在粪便和血清样品中未见检测到猪HEV核酸RNA的文献报道，猪急性戊型肝炎转为慢性戊型肝炎的病例也未见报道[22-23]。以上结果说明，猪急性戊型肝炎主要集中在4月龄以下的猪群中。同时，在实验室条件下，猪感染HEV后，HEV抗体从感染后第2周开始出现，并会一直持续到第5周（但1月龄以下的仔猪检测不出HEV抗体）。其中，HEVIgM抗体会很快降低到无法检出，而HEVIgG抗体则会一直存在于血清中。因此，区分猪急性戊型肝炎和猪慢性戊型肝炎，除猪HEV核酸RNA的检测结果外，还要结合猪HEV抗体的检测结果进行综合判定，单纯的猪HEV核酸RNA检测或单纯的猪HEV抗体检测，均可能导致误判[24]。

具体来说，在同时检测到猪HEV核酸RNA和HEVIgM抗体时，即可判定为猪急性戊型肝炎。而当猪HEVIgM抗体已降低至无法检出时，即猪HEVIgM抗体检测结果为阴性，猪HEVIgG抗体检测结果为阳性[可长期（约2年）检测到猪HEVIgG抗体[25]]，猪HEV核酸RNA检测结果为阳性时，表明病猪的免疫系统已无法清除猪HEV病毒，即可判定为猪慢性戊型肝炎。

考虑到病毒潜伏期造成的漏诊、误诊，需要进行多次重复检测，以排除潜伏期的假阴性结果。

3.2 猪戊型肝炎诊断结果的评估

对猪戊型肝炎诊断结果的评估，可使用定量RT-PCR作为参考标准，通过计算总体一致性百分比、敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）和Cohen’s kappa统计量，来评估每个分析的性能，并得出交叉表，从而进行诊断结果的评估。

4 小 结

猪戊型肝炎与人戊型肝炎的基因同源性非常高，猪HEV可跨种传播感染人类，且猪HEV传播感染到人类后，其毒力会大大增强[26]，从而给公共卫生安全带来了极大隐患。另外，由于目前还没有用于动物的HEV疫苗。因此，准确有效地诊断出猪戊型肝炎，尽快隔离、清除受猪HEV感染的病猪，避免其他健康猪受到猪HEV的感染就显得尤为重要。这样不仅可以保障养殖环境的健康安全，保证猪源性食物产品源头的健康安全，也是切断人感染戊型肝炎的关键措施之一。