沃尔巴克氏体控制媒介伊蚊的应用及前景

龚君淘，刘起勇，王以燕，洪晓月，奚志勇，5*

(1.广州威佰昆生物研究院，广东 广州 510535；2. 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所媒介生物控制室，传染病预防控制国家重点实验室，感染性疾病诊治协同创新中心，世界卫生组织媒介生物监测与管理合作中心，北京 102206；3. 农业农村部农药检定所，北京 100125；4. 南京农业大学植物保护学院，江苏 南京 210095；5. 密歇根州立大学，美国 东兰辛MI 48824)

沃尔巴克氏体作为在节肢动物门尤其是昆虫纲中普遍天然存在的一类母系遗传胞内共生菌，因其诱导宿主表达多种特殊生物学表型，近年来逐渐成为一种高效、安全、经济且对环境友好的新型微生物农药。被人类从尖音库蚊生殖组织中首次发现[1]的近百年光阴里，科学家对这类细菌的研究从未停止。近20年，少数“明星”菌株在果蝇、蚊子等昆虫中的研究引起广泛关注，尤其是其诱导宿主产生胞质不亲和(cytoplasmic incompatibility，CI)和对人类病原体抗性(pathogen blocking，PB)机制[2]，至今仍未被完全阐明。而对沃尔巴克氏体与其宿主间共生关系的研究，已成为阐述和强化内共生生命活动综合性规律的范例[3]，同时也为重大卫生和农业害虫防治提供了新思路。

埃及伊蚊与白纹伊蚊常年在热带和亚热带地区传播登革热、寨卡、基孔肯雅热和黄热病等多种蚊媒疾病。其中，由登革病毒大流行导致登革热疫情呈快速上升趋势，威胁着全球40%以上人口的生命健康[4]。传统化学农药依然是防治这类蚊媒传染病的主要手段，但往往在付出高昂成本的同时产生环境污染、抗药性增长以及对非靶标生物误伤等问题。此外，蚊媒的化学防治受人员聚居场所复杂、化学农药品种和产品剂型有限、施药方式简单等因素影响，还存在施药精准度差、持效期短等问题。进入21世纪，在媒介生物综合治理(integrated vector management，IVM)基础上，媒介生物可持续控制(sustainable vector management，SVM)的创新理念和模式为我国重大蚊媒害虫防治提出了新要求[4，5]。

1 背景简介

蚊媒一般天然不携带或携带不具有防治意义的沃尔巴克氏体菌株，需通过人工转染方式建立新目标昆虫品系。2005年，奚志勇等人应用昆虫胚胎显微注射技术，首次通过胞浆转移成功建立了埃及伊蚊人工转染品系，并完善了以此为基础的蚊媒生物控制基本原理[6]。这一突破降低了人工建立伊蚊沃尔巴克氏体转染品系的技术门槛，加速推进了这类基础科研成果向应用技术的转化。

种群压制和种群替换作为两个主要应用模式是目前沃尔巴克氏体转化科学中的主要内容(图1)。种群压制利用沃尔巴克氏体诱导的CI表型，在控制区持续释放人工转染雄蚊诱导不育以达到压制目标伊蚊种群的模式。种群替换则将人工转染种群释放到控制区域后，通过CI赋予的生殖优势，逐渐替换野生种群，再由沃尔巴克氏体诱导宿主表达对病原体的抗性，最终实现在释放区域内阻断蚊媒病的传播。两种模式对释放量要求也各不相同，种群压制更偏向于传统淹没式释放(inundative release)，释放雄蚊数量需要在起始时期维持在野生雄蚊的数倍以上才能确保防效。种群替换则类似于接种式释放(inoculated release)，释放种群中含有相较于野生蚊一定比例的雌蚊量即可达到触发种群替换的起始阈值，在被释放到控制区一段时间后可自发“清洗”和替换掉野生种群从而阻断病毒传播。简而言之，种群压制效果类似于施用靶标专一的杀卵剂，学术上称之为沃尔巴克氏体诱导的昆虫不相容技术(incompatible insect technique，IIT)[7]；种群替换则更像为病媒昆虫接种疫苗，学术上称之为沃尔巴克氏体诱导的病原阻断技术(pathogen blocking technique，PBT)(图1)。在实际应用中，两种模式一般根据当地利益相关者、病媒控制基础设施、人类生活方式、流行病学及昆虫学背景等特定条件做出选择和部署。另外，它们还可以相互配合或与其他控制手段相结合使用。

图1 两种模式应用原理示意图

2 种群压制模式在蚊媒控制中的应用

得益于世界不同地区库蚊携带不同型的沃尔巴克氏体菌株，上世纪60年代，通过在缅甸仰光附近一个小村庄连续近3个月每天释放0.5万只沃尔巴克氏体感染的不育雄蚊，成功地根除了当地一种丝虫病的主要媒介——致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)[8]。随着技术的发展，沃尔巴克氏体在伊蚊防控中的应用逐渐进入大众视野，成功案例也被频繁报道[9，10]。

2009年在法属玻利尼西亚率先拉开种群压制现场试验的帷幕。感染来自河流伊蚊(Aedesriversi)沃尔巴克氏体的波利尼西亚伊蚊(Aedespolynesiensis)被用于控制当地传播淋巴丝虫病的野生种群，并达到一定效果[11]。2014年，美国环境保护署(EPA)批准在肯塔基州列克星顿市进行小规模现场试验并颁发许可证(89668-EUP-1)。连续17周、每周释放1万只wPip菌株(来自库蚊)感染的白纹伊蚊雄蚊后，释放区雌蚊密度与卵孵化率均发生显著下降[12]。此次现场实验在总结时也鼓励在不同环境背景及更大规模现场中进行更多的研究以验证这类技术的可行性。在2015～2017年，我国在农村农业部药效许可下，选择在登革热高发的广州市启动了沃尔巴克氏体感染不育雄蚊的现场释放试验，wPip-PAB白纹伊蚊雄蚊在每年4～11月被释放在试验区沙仔岛和大刀沙。该试验最终将释放区雌蚊密度和幼虫孵化数的压制率均提高到94 %以上，压制效果也稳定控制在90 %的水平，甚至在释放区有超过6周没有监测到雌蚊。释放区伊蚊叮咬率也出现90 %的下降，大大降低了蚊媒疾病的传播风险[13]。该项目的成功获得世界卫生组织(WHO)对沃尔巴克氏体控蚊技术的充分认可，也让其看到中国在该领域基础研发已取得阶段性成果。

近5年，沃尔巴克氏体作为一种以种群压制为目的的新型微生物农药已在美国、澳大利亚、中国、新加坡和泰国等8国成功应用于当地蚊媒防控中。2016年，为应对突发于南美洲的寨卡病毒在美国本土传播流行的威胁，由奚志勇等人于2005年建立的埃及伊蚊wAlbB菌株转染品系扩繁饲养得到的不育雄蚊被释放到南迈阿密近170英亩区域，释放区域的埃及伊蚊种群密度相较于对照区发生显著下降[14]。之后，wAlbB感染的埃及伊蚊品系在新加坡、美国、墨西哥和澳大利亚等国被用于当地埃及伊蚊种群压制现场试验。各地释放现场试验结果均显示有良好(50 %～80 %)的压制效果，其中在美国加州夫勒斯诺市释放现场的平均压制效果高达95 %[10]。

2018年1～5月，在澳大利亚北部300万感染wAlbB菌株的埃及伊蚊雄蚊在20周内被释放到三个独立区域中，与对照组相比，所有释放区野生种群下降率均远超80 %[15]。跟踪观察发现，有一个释放区在停止释放后的一个观测季度甚至更长时间里几乎没有发现成蚊踪影。另外两个释放区的蚊媒密度，一个恢复到之前水平，另一个则维持在原来水平的一半[15]，该效果与广州现场观察到的一致。这些结果表明种群压制模式在实际应用中的持效性远胜于预期。同期在新加坡进行的一项为期3年的埃及伊蚊种群压制现场试验还证实了这种应用模式不仅能在当地压制九成以上的野生种群，同时也可降低71%～88 %的登革热发病率[16]。

3 种群替换模式在蚊媒病控制中的应用

沃尔巴克氏体的种群替换模式近10年已在澳大利亚、印度尼西亚、马来西亚、巴西和越南等15个国家被引入现场应用。2011年，wMel株系感染的埃及伊蚊首次被用于澳大利亚凯恩斯市2个郊区的登革热的控制。持续9～10周分别释放14.16万和15.73万只成蚊后，2个释放区的野生种群wMel感染率均达到90 %以上，在1年后复检中依然稳定存在，且对登革病毒仍有良好拮抗能力[17]。跟踪调查显示，在当地种群中建立的wMel感染在10年后依然稳定维持在高水平，且菌株基因组相较于10年前几乎无显著差异[18]。

2017年初，感染wAlbB的埃及伊蚊用于在马来西亚吉隆坡的种群替换现场试验并成功在当地建立了稳定高感染种群。随后发现，与对照区相比，释放区人员登革热发病率平均降低了约40 %，表明感染wAlbB的埃及伊蚊为种群替换的登革热防控模式提供了新选择[19]。同年在印度尼西亚日惹市的一项种群替换现场试验也悄然展开，在积累大量数据和经验后，通过随机分区方式将此市登革热疫区作为试验区均分为24个互相镶嵌的小型地理集群(Clusters)，其中12个集群作为种群替换控制区(释放wMel感染的埃及伊蚊)，而另12个作为对照区。在种群替换完成后，对24个地理集群的登革热病例统计发现，沃尔巴克氏体对当地登革病毒传播阻断效果显著：病患感染率降低77.1 %，而重症住院率降低86.2 %[20]。由澳大利亚莫纳什大学的“世界蚊虫计划”(World Mosquito Program，WMP)团队及其在当地的研究伙伴所完成的此项研究，参考了前人最初用于评估疫苗对病原体有效性的群集随机对照试验，也是WHO一直以来认定并推荐测试此类方案抗病效果的“金标准”。至此，种群替换与种群压制的现场试验的关注重点，同时从对野生种群的干预转变为对释放区域人员的流行病学临床保护上。

综上所述，两种模式殊途同归，最终均能达到理想的稳定持续阻断蚊媒传染病传播效果。近年除我国白纹伊蚊种群压制防治项目外，以wMel或wAlbB菌株感染的埃及伊蚊为代表的蚊种在蚊媒控制现场应用中表现出高效稳定干预效果(表1)，将该领域转化科学推到新高度[21]。限于我国登革热疫情多以季节性输入为主，故在研项目尚未开展流行病学研究以测试疾病阻断效果。

表1 沃尔巴克氏体的媒介伊蚊控制代表性案例汇总*[20，21]

4 在应用中的生物安全风险及效益评估

4.1 生物安全风险评估 沃尔巴克氏体在两种应用模式的生物安全风险评估中具有以下特点：

4.1.1 天然存在却无法感染人或其他脊椎动物 沃尔巴克氏体在节肢动物中普遍存在，半数以上的昆虫体内天然携带这类细菌并与之共生长达数百万年之久。而沃尔巴克氏体无法感染脊椎动物，人类从未因被天然携带沃尔巴克氏体的蚊子或蜘蛛叮咬而感染，也未因携带沃尔巴克氏体的农业害虫通过粮食作物或污染食物被感染，在以往10多年现场应用报道中均未见对脊椎动物的不良影响。早期实验数据显示，将感染沃尔巴克氏体的蚊卵巢匀浆悬液经腹腔和脑腔注射接种到小白鼠体内，2个月后小鼠生长正常，其器官微生物检测阴性，未发现引起任何症状和死亡；将感染沃尔巴克氏体的蚊卵巢或其匀浆悬液接种到鸡胚胎中，10～15d后胚胎微生物检测阴性[22]。此外，研究发现沃尔巴克氏体不能穿过蚊子唾液管，故其唾液中不含沃尔巴克氏体；免疫学研究也证实感染沃尔巴克氏体的埃及伊蚊无法通过其叮咬所注射的唾液将其传播到人体，接受数以千次叮咬的志愿者体内也未产生针对沃尔巴克氏体的IgG抗体[23]。

4.1.2 只能在宿主细胞内复制并经卵传递，难以水平传播，不能从蚊传播到天敌和环境中 沃尔巴克氏体是专性胞内共生菌，无法离体培养，只能通过宿主母系细胞质进行母子间经卵传递(垂直传播)，一般无法在种内或种间传播。目前几乎所有水平传播案例都是通过对沃尔巴克氏体的种群遗传进化研究推测得到，自然界和实验室中均无法直接观察到水平传播并达成稳定感染现象。研究显示，向6种(以蚊子为食的常见跳蛛种、2种桡足类动物、2种以孑孓为食的小型鱼类及1种掠食性巨蚊)不同自然捕食者分别饲以感染沃尔巴克氏体埃及伊蚊不同日龄的成虫和幼虫，均未发现沃尔巴克氏体对其捕食趋性的影响，也未发现向其水平转移的痕迹，研究同时也证明沃尔巴克氏体不能从蚊传播到其周围环境中，包括土壤、植物、蚯蚓和千足虫[24]。

4.1.3 种群压制模式下的靶标专一性且交配后会自然死亡 用于种群压制的不育雄蚊只针对释放区域内相同的传病蚊种，对生境中其他动物的误伤概率极低。雄蚊在野外寿命小于14d，在与野生雌蚊交配后会自然死亡并在环境中降解。由于传病蚊种只是生态链中众多昆虫(包括蚊)种类的一种，其清除也不会对释放区域生态产生负面影响[25]。事实上通过释放沃尔巴克氏体感染雄蚊正在夏威夷应用于清除入侵蚊媒，保护当地濒临灭绝的珍稀鸟类，以恢复被破坏的生态链(Endangered Hawaiian Birds Conservation |Birds Not Mosquitoes)。

4.1.4 对蚊媒疾病传播风险的有效限制 种群压制模式直接降低释放区域内蚊媒数量，进而降低野生传病雌蚊的叮咬率，实现降低或阻断登革等蚊媒病毒的传播；种群替换模式能在完成对野生种群替换后很长一段时间阻断病原在人蚊间传播。种群压制模式只释放感染沃尔巴克氏体的不育雄蚊(雄蚊不吸人血)，而种群替换中释放的雌蚊不具传病能力或其能力较野生蚊显著降低，因此，无论释放雄蚊还是雌蚊，这两种模式对人类健康均不存在安全风险。

2016年有人曾对于沃尔巴克氏体在现场释放时可能在非靶标昆虫间水平转移问题及可能带来与农药类似的施用风险提出过质疑，并表达对沃尔巴克氏体感染蚊子在应用中缺乏相关法律法规管控的担忧。很快这些疑虑得到该领域专家O’Neill和Dobson等人的回应[26，27]。O’Neill提到在当时已有澳大利亚为首的5个国家(至今已有12个国家)批准他们基于种群替换的消除登革热计划，每一项风险分析评估结论都显示释放沃尔巴克氏体感染伊蚊所带来的风险可忽略不计[28]。事实上，自2010年澳大利亚启动释放至今的12年，没有关于沃尔巴克氏体在现场应用中的负面报道。

澳大利亚释放雌蚊以消除登革热的种群替换项目不仅获得澳大利亚农药和兽药管理局(APVMA)批准，还取得当地社区的认可和释放许可。2017年，美国EPA根据联邦杀虫剂、杀菌剂和杀鼠剂法(FIFRA)，批准携带沃尔巴克氏体wPip株系的ZAP雄蚊(白纹伊蚊)作为微生物农药取得注册登记(89668-4)，并允许在有白纹伊蚊分布的22个州推广使用。在澳美之后，以新加坡、巴西为代表的对登革热防控需求强烈的国家也快速批准并启动了一系列转染埃及伊蚊的释放项目(表1)，并在政府层面给予强有力的支持和帮助，其中新加坡项目由政府(环保署)直接主导，其独立风险评估结论也是释放沃尔巴克氏体感染雄蚊带来的生态和公共卫生风险可忽略不计，与其他各国一致[29]。

4.2 风险管控措施 对于沃尔巴克氏体技术在应用中的生物安全风险的有效管控措施主要包括以下几个方面：

4.2.1 完善的研发和生产体系建立 主要包括针对目标蚊种充足的生物学背景研究、对生产和释放工艺流程严格把关和持续优化、高效适用的种质资源库的建立与更新、强有力的技术和工程合作等。近10年我国在这方面已有积累，具备生产和使用的规程及经验，先后以交流合作的方式与一些国际机构、大学及研究单位建立联系，为其他饱受蚊媒疾病困扰的国家和地区提供培训、分享我国经验、技术和方法。

4.2.2 精准可控的应用方法 沃尔巴克氏体感染伊蚊在释放过程中使用标记(或通过快速诊断直接追踪)-释放-回收监测手段(mark-release-recapture，MRR)[30]能够准确获取并预测释放现场沃尔巴克氏体蚊和野生伊蚊种群动态信息，用于科学指导释放节奏。在寻求防效与成本间平衡点的同时，相较于传统农药施用更加精准可控。

4.2.3 规范监管 官方规范管理为这类新技术安全应用保驾护航，以美国为例，对用于种群压制不育雄蚊的监管主要明确允许使用期限及行政区域、保证分销渠道的合法及可追溯、要求定期提交质检报告和监测结果、要求定期公开审查所需的数据、要求提供监测中相应补救措施等方面的内容。美国EPA自2011年就开始将感染沃尔巴克氏体雄蚊作为一种生物农药加以规范使用，并颁布包括波利尼西亚伊蚊、白纹伊蚊和埃及伊蚊等在内一系列现场释放官方许可[26]。

上述美、澳等国成功应用和推广表明，两种应用模式在措施严控下引起生物安全风险可能性极低，已具备稳定性和可靠性，均逐渐成长为成熟的前沿蚊媒控制技术。

4.3 经济效益 随着沃尔巴克氏体作为新型微生物农药被多个国家认可并逐渐形成了以人工饲养的产品蚊和现场施用服务相结合的新兴市场，其在实际商业化应用中的价值或收益也一直被广泛关注。已有的研究分别针对在印度尼西亚日惹市进行的种群替换和在新加坡进行的种群压制进行评估，发现两种模式在高密度人口的登革热高发地区均能够获取很高收益。其中，日惹市实时释放数据预测wMel感染的埃及伊蚊对登革热流行区域干预后的综合效益-成本比(benefit-cost ratio)能达到可观的1.35～3.40。而在登革热流行的高收入国家新加坡进行现场释放试验中，结合以往经济学和流行病学数据发现，如在2010～2020年采用沃尔巴克氏体技术，即便干预效果只有40 %，也可为当地政府节约3.29亿美元(以2010年币值计算)的开支[31]，而使用这项技术每年的支出仅为每年2 270万美元(同样以2010年币值计算)[32]。以澳大利亚和新加坡等国为代表，这类技术在政府、社会资本和民众需求的大力支持下快速迭代发展，其在应用中的经济和社会效益也已显现。相比之下，作为研发、生产和应用技术已领先的我国，在广东地区进行不育蚊释放的项目仍然处于小规模药效试验阶段，其在更大规模场景的应用仍需支持和探索。

在实际使用中，基于成本考虑对两种模式的使用也需有所权衡。种群替换优势在于所需的释放量小，且不需要在生产中对产品蚊进行雌雄分离，成本较低。此模式最终目的主要是阻断蚊媒病传播，而非降低释放区域的蚊虫叮咬率。种群压制则是通过释放数倍于野生种群的雄蚊，直接将野生蚊媒密度压低甚至根除，使释放区蚊虫叮咬率显著下降至传病阈值以下，进而达到阻断蚊媒病传播效果。由于种群压制模式对产品雄蚊产量和生产工艺的双重要求，其成本相较于种群替换大幅增加数倍甚至数十倍之多(受不同防治区域蚊媒密度、当地经济发展水平及药效指标等影响)。因此，推荐经济实力相对薄弱且对蚊媒病控制需求强烈地区优先考虑成本较低的种群替换模式，而推荐条件允许且对蚊媒病和蚊虫叮咬控制需求同等强烈地区优先考虑种群压制模式。当前，种群替换因在蚊媒疾病防控的刚需国家和地区现场试验的良好表现及相较于种群压制成本优势，逐渐取得更多有力的资金和政策支持。在广州采用种群压制模式防治登革媒介白纹伊蚊的使用成本受多种因素影响，由于项目启动较早，规模化生产、运输和释放等一系列实施已较为成熟，加上华南地区的供应链优势，目前在广东地区(产地)已具有一定经济性(2017年之前以13～175美元生产约1.16～15.81万不育雄蚊/公顷/周)[13]，具有向其他需求地区推广的价值。

综上所述，沃尔巴克氏体作为一种高效微生物农药，不仅能够有效解决热带蚊媒疾病的防控问题，还蕴含着商业潜力，对不同经济背景的需求对象所制定干预方案也具有一定灵活操作空间。此外，沃尔巴克氏体的两种应用模式相较于化学农药在固定区域的长期施用还具有明显优势，一旦种群压制和种群替换达到预期效果，在未来的很长一段时间里维持同水平防效的成本相较于化学农药年复一年的单调重复施用具有显著的经济优势。

5 前景

沃尔巴克氏体控制媒介伊蚊的应用作为当前其转化科学领域发展最快，成熟度最高的分支之一，已初步成熟并完成从基础科学研究向应用的成功转化。在国际上，除以学术为主的科创团队外，诸如新加坡国家环境局(NEA)、国际原子能机构(IAEA)、世界卫生组织(WHO)、谷歌(Google)以及比尔及梅琳达·盖茨基金会(Bill & Melinda Gates Foundation)等一些政府机构、商业公司、国际组织以及公益组织等也逐步提高在该领域的关注和投入。仅以盖茨基金会为例，与其他信托基金会自2010年起对上述WMP团队的资助规模就已经达到1.85亿澳元[33]。谷歌通过Alphabet公司旗下的子公司Verily甚至直接启动了沃尔巴克氏体感染的埃及伊蚊在美国加州的生产以及现场释放项目，并首次将人工智能技术引入其中[34]。在本文即将发稿之际，世界卫生组织向全球公示沃尔巴克氏体的目标产品特性(Target Product Profile)，为其作为登革热防控的公共卫生产品向全球推广提供标准，预计获世界卫生组织认证的沃尔巴克氏体不久将像新冠疫苗一样为人类健康发挥更重要的贡献[35]。

尽管有上述种群压制应用试验取得成功的案例，并在国际上引起广泛关注，但当前我国对这类新型微生物农药的关注和投入与一些发达国家仍存在较大差距。这类技术的发展和国际间多边合作，不仅能够增强我国在公共卫生领域的科技储备能力，保障人民安全和健康，还能够建立或增进我国与需求国家和地区之间的联系，符合“一带一路”和倡导人类命运共同体意识的基本和平发展观念。因此，沃尔巴克氏体技术作为一种新型、有效的虫媒防控手段，在我国本土的研究和推广具相当的优先性和急迫性，对我国有效应对和降低近年来日益频发的全球性公共卫生事件具有战略意义。