食品与饲料中致病微生物检测技术及展望

武侠均

（唐山市食品药品综合检验检测中心，河北 唐山 063000）

影响人类食品和动物饲料产品质量安全的因素有很多，其中致病微生物污染是最重要因素之一。致病微生物就是能够导致人类和动物疾病的微生物，其可直接影响人类食品和动物饲料产品的质量与安全，进而危害人类和动物健康，给畜牧业生产造成重大损失，甚至引发公共安全事件。因此，饲料和食品中致病微生物的检测技术很早就成为了人类研究的重要课题之一。

饲料和食品中致病微生物的检测是在微生物鉴定学科基础上发展起来的一门应用技术。随着微生物学研究的不断深入和新技术的应用，致病微生物检测技术也得到了很好的发展。目前，在我国现行有效的饲料和食品检测标准中，传统方法和现代技术同时存在，但传统方法占据主导地位，所有标准的仲裁方法都是采用的传统经典方法。现代技术多在行业标准中出现，尤其在出入境标准中较多，尽显其开放、快速、高效的行业特点，但阳性样品的最终鉴定仍然要依赖传统的鉴定方法。本文对现行有效的国家标准、行业标准和地方标准进行了分类归纳和总结，并提出了一些技术上的问题和思考，以期能够对饲料和食品质量安全检测工作，以及相关标准的制修订工作有所裨益。

1 常见致病微生物及其危害

目前，饲料和食品质量安全监测中常见的致病微生物主要是肠道微生物，例如沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特氏菌、大肠埃希氏菌、大肠菌群、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、霉菌等。

1.1 致病微生物的危害 饲料和食品中的致病微生物主要是引起肠道反应和中毒症状，影响畜牧业生产和人类生活，甚至危及动物和人类健康。以沙门氏菌为例，鼠伤寒沙门氏菌病在世界公共卫生学上是一类危害极大的人畜共患病；沙门氏菌属肠杆菌科，感染后可导致人和动物中毒，引起胃肠炎、伤寒和副伤寒、败血症等，严重时可以造成人和动物死亡（蒋培红，2007）。有资料显示，沙门氏菌污染是美国食品中毒死亡的主要因素之一。全美每年报道约4万人被感染致病，而实际患病人数可能超过报道人数的20倍（许多轻症患者因未就医，而未被统计）；据不完全统计，每年约有上千人死于沙门氏菌急性感染。

2.2 霉菌毒素的危害 许多微生物在生长和繁殖过程中会产生大量有毒物质，其中以霉菌毒素最为常见，而且危害最大。这类微生物主要包括曲霉菌属、青霉菌属和镰刀菌属等，其产生的毒素以黄曲霉毒素、呕吐毒素、赭曲霉菌毒素、雪腐镰刀菌烯酮、玉米赤霉烯酮较为多见。以黄曲霉毒素为例，黄曲霉毒素是由黄曲霉菌、寄生曲霉菌产生的次生代谢产物，其化学结构类似，是一类二氢呋喃香豆素衍生物，主要有B1、B2、G1、G2，以及两种动物代谢产物M1、M2。黄曲霉毒素被世卫组织界定为一类致癌物质，其毒性是氰化钾的10倍、砒霜的68倍，其毒害作用主要是对人类及动物的肝脏造成伤害，可引发肝炎、肝硬化、肝坏死等（马建等，2012）。黄曲霉毒素B1也是饲料和食品污染中最为常见的毒素之一，其毒性和致癌作用也最强。据报道，20世纪60年代发生在英国的大量火鸡突发性死亡事件，是由于使用了被黄曲霉毒素污染的花生粕造成的。花生和玉米籽实是最容易被黄曲霉毒素污染的饲料和食品加工原料。

2 致病微生物检测技术现状

目前，饲料和食品中致病微生物检测技术分为传统检测技术和现代快速检测技术两大类。但无论是动物饲料，还是人类食品的检测，国家标准和仲裁标准主要以传统技术为主，现代技术应用较少，目前主要出现在行业标准和地方标准中。从现有的饲料和食品中致病微生物检测技术来看，致病微生物的检测大致分为两大步骤，一是增菌与分离培养，二是分类鉴别与鉴定。

2.1 传统检测技术及其应用 传统检测技术是在细胞形态学和习性水平上，通过观察微生物的细胞与菌落的形态、大小，及其生理特性、生化反应等特征对其进行微生物学分类鉴别的方法。现阶段，在我国现行有效的饲料致病微生物检测国家标准中饲料中霉菌总数、大肠菌群、细菌总数、志贺氏菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌等检测标准均采用的是传统技术；现行有效的36个“食品安全国家标准《食品微生物学检验标准（GB 4789）》”中大多采用的也是传统方法。

2.1.1 传统经典检测方法 经典的检测方法其过程包括增菌和预增菌、分离培养、形态学观察、生理/生化鉴别、血清学鉴别五个步骤。增菌和预增菌是使饲料或食品中的目标菌和因为贮存或加工而受伤的目标菌复壮和增殖的过程。分离培养是将待分离的目标菌通过一定的方式接种在适当的平板培养基上，使其细胞(或孢子)尽量分散，并长成一个个纯种的单个菌落的过程。形态学观察是通过肉眼观察目标菌落的大小、形状、光泽度、颜色和透明度等特性，或通过显微镜和染色技术观察细菌的大小、形状等特性，对其进行形态学鉴别。生理/生化鉴别是根据微生物对营养需要的不同，及其代谢产物的一些特定化学反应，通过观察其生长状况、化学反应产物，以及化学反应产生的颜色变化和现象，对其进行分类鉴定。血清学鉴别是根据微生物免疫学抗原/抗体特异性反应，对其进行分类、细分鉴定。经典方法的鉴定指标见表1。

表1 经典方法鉴定指标

2.1.2 传统快速检测系统 传统的经典方法最繁琐的工作是在生化鉴定和血清学鉴定环节。为了解决这个问题，市场上出现了许多简单、快速、标准化的快速检测产品。例如细菌用API系统、Enterotube系统和Biolog自动化或半自动化快速检测系统等。

API细菌数值鉴定系统其代表产品为法国公司生产的API鉴定系统，该系统能鉴定700多种微生物；Enterotube快速鉴定系统（肠管系统）是由美国Roche公司生产的一类产品，与API鉴定系统类似;Biolog快速鉴定系统是由生化反应部分、检测设备和计算机系统组成，可鉴定1140余种微生物，几乎囊括了目前已知的所有人类致病菌，该系统由美国安普科技中心生产;全自动微生物分析系统(AMS)包括生化反应及微生物检测系统和计算机分析系统，是一种运用概率最大近似模型技术对检测数据进行分析的致病菌分类鉴定技术；Vitek-AMS自动微生物检测系统是法国生物梅里埃集团公司生产的，目前是最先进、自动化程度最高的生物鉴定系统之一（周庆德，2005）。

2.2 现代快速检测技术及其应用 近20年来,随着基因组学、结构生物学、生物信息学、PCR技术和现代仪器分析技术的不断发展与应用，微生物鉴别研究取得了突破性的进展，致病微生物的检测技术也从细胞形态学水平发展到分子学水平。现代快速检测技术是在分子学水平上应用现代科技手段，通过分析微生物细胞的组成成分、蛋白质结构、基因序列等遗传物质对其进行分类鉴别的技术，其检测过程主要包括增菌和预增菌（分离）、免疫或分子鉴定两大步骤。

目前，采用现代快速检测技术的饲料和食品检测标准很多。为了便于大家了解，本文根据方法原理将这些技术分为以下四大类：免疫识别技术类、核苷酸测定技术类、核酸杂交技术类、细胞成分分析技术类。

2.2.1 免疫识别技术类 利用生物抗原-抗体特异性反应的原理，使试样中的目标菌抗原与抗体结合形成抗原与抗体的复合物，再通过化学染色技术或生化反应等方式，达到对致病微生物进行分类鉴定的目的。

2.2.1.1 免疫反应色谱法 目标菌抗原与滤纸或硝酸纤维素滤膜上经过标记的抗体进行特异性结合，形成抗原-抗体复合物，复合物在毛细管作用下沿滤膜移动，当遇到被固定在滤膜上样品检测区的特异性抗体后被截留集聚下来，形成一条色带，据此来判断是否存在目标菌抗原。在免疫反应色谱法中常见的抗体标记技术有化学发光剂法和胶体金法。DB34/T 816-2008是应用免疫色谱技术制定的检测饲料中沙门氏菌的地方标准，该标准方法对配合饲料和单一饲料的检出限达到了25 g饲料中1个沙门氏菌的水平；SN/T 0184.4-2010是应用胶体金标记技术建立的食品中李斯特氏菌的检测方法标准，其检测灵敏度达到1×106CFU/mL。

2.2.1.2 酶联免疫法 将目标抗原抗体（一抗）包被在固相容器内，加入目标菌抗原，使之与抗体（一抗）结合形成抗原抗体复合物Ⅰ，洗掉未结合的其他物质；加入特异性酶标抗体（二抗），使之与抗原复合物Ⅰ结合形成新的抗原抗体复合物Ⅱ，再次洗涤去除其他成分，加入特定反应底物与抗原抗体复合物Ⅱ反应生成荧光化合物或有色化合物；然后检测其荧光强度或吸收度，通过与参照值进行比较，得到检测结果。雷风等（2005）将抗体固定在硝酸纤维素薄膜上,制定了饲料中沙门氏菌斑点酶联免疫吸附检测方法,其沙门氏菌最低检出限为400个/mL；对100份饲料进行方法比对试验检测，沙门氏菌阳性检出率为43%，与常规方法38%无显著差异；伍燕华等（2014）以福尔马林灭活的鼠伤寒沙门氏菌制备抗沙门氏菌多克隆抗体建立了沙门氏菌双抗ELISA检测方法，可以检测五种典型的沙门氏菌；并在其他杂菌存在的情况下，具有较好的灵敏性和特异性；纯培养液的最低检测限为1×104CFU/mL。

2.2.1.3 免疫磁珠法 免疫磁珠技术是丹麦学者1977年提出的，利用外层包裹着单克隆抗体（McAb）的磁性微珠（直径1～2 μm）与溶液中相应的生物大分子进行特异性结合，用磁铁收集磁珠，把目标大分子或细菌（蛋白质、多糖、DNA、RNA）从样品中快速分离出来，然后再利用生化和血清学反应、荧光技术或生物发光技术进行鉴别分类。SN/T 1059.5-2006用包被了大肠杆菌（E.coli）O157抗体的免疫磁珠分离富集目标菌，通过选择性培养和生化反应产生的颜色变化判定目标菌的存在。王壮等（2014）将空肠弯曲菌特异性多表位人工多肽抗体包被在磁性微珠上，制成的免疫磁珠排除了非空肠弯曲菌（包括其他弯曲菌）的干扰，对空肠弯曲菌具有较好的特异性；2 mg免疫磁珠在1mL浓度为2.5×103CFU/mL的空肠弯曲菌菌液中富集并培养出100～300 CFU的目标菌落，具有较好的敏感性。寇晓晶等（2019）利用免疫磁珠富集技术和ATP发光技术相结合建立的快速检测3种常见食源性致病菌金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌的新方法，在明显缩短预增菌时间的情况下，利用免疫磁珠的富集作用，取得了与传统增菌方式相同的检测结果。

2.2.1.4 量子点免疫荧光法 量子点又称纳米晶，是由Ⅱ-Ⅵ族元素制成的纳米级微粒，其粒径为1～10 nm。由于电子和空穴被量子限域，连续的能带结构变成了具有分子特性的分立能级结构，受到激发后可发射荧光。

量子点免疫荧光法是一种量子点免疫荧光组织化学技术（QD-IHC），又称量子点免疫荧光细胞化学，是根据抗原-抗体特异性结合的原理，用量子点标记特异性抗体作为探针，检测微生物细胞中抗原性物质的一种新技术。量子点免疫荧光组织化学技术主要有直接法和间接法，间接法因二抗的放大作用而具有更高的敏感性。薛峰和张睿（2013）利用量子点荧光标记技术将目标菌特异性抗体制成量子点标记抗体，增菌液用免疫磁珠富集目标菌株，富集的目标菌磁珠与量子点标记抗体进行特异性抗原抗体反应而结合在一起；在紫外光激发下通过荧光显微镜观察结合物表面的荧光，以判定是否存在目标菌；并制定了出口食品中空肠弯曲菌检测的行业标准。刘晓红等（2011）将荧光量子点标记在炭疽芽孢杆菌抗原上，建立了利用荧光量子点标记-免疫分析技术测定炭疽芽孢杆菌的方法；运用该方法检测炭疽芽孢杆菌，在1.0×102～1.0×106CFU/mL有良好的线性关系，而且与同属其他杆菌混合检测，具有良好的特异性。Wu和谢冰（2014）利用山羊抗大肠杆菌抗体和兔抗山羊抗体的特异性结合的特性，对大肠杆菌进行量子点标记，建立了用荧光量子点标记抗体作为探针检测化学药物中的大肠杆菌的方法；该方法对盐酸氯米帕明药物中大肠杆菌的检测有良好的特异性和回收率,而且检测用时不到4 h。

2.2.1.5 垂直膜过滤法 本方法是通过垂直过滤的方式，使试样通过包被有目标菌抗体的滤膜，其中的目标菌抗原与滤膜上的特异性抗体结合成抗原抗体复合物，通过酶偶合反应将抗原抗体复合物显色，达到定性鉴别的目的。SN/T 1059.6-2016是将沙门氏菌抗体包被到滤膜上，用于富集检测食品中沙门氏菌的食品进出口行业标准。曹春梅等（2005）利用针对含有O9抗原沙门氏菌的单抗3-47-0和胶体金标记的羊抗鼠IgG抗体，以微孔滤膜作载体，建立了一种用于临床医学检测含有O9抗原沙门氏菌的斑点金渗滤方法；该方法适用于目前已知的含有O9抗原的所有沙门氏菌的检测，且不受其他沙门氏菌、肠杆菌科和常见革兰氏阳性菌的干扰，特异性较强；肠炎沙门氏菌的检测限为6×104CFU/斑点，且用时不到10 min。

2.2.2 核苷酸测定技术类 利用酶链式反应PCR技术和DNA限制酶的酶切功能，将目标菌的DNA切割成大小、长短不等的核苷酸片段，通过琼脂糖电泳或其他仪器设备对其进行基因序列分析测定，然后再通过与阳性样品或基因图谱数据库进行比较，从而对致病微生物进行分类鉴定。

2.2.2.1 单菌种聚合酶链式反应（PCR）法 样品经过预增菌和选择性增菌处理后，其中的目标菌抗原在沸水浴条件下，菌体细胞破裂释放出基因组DNA，离心使细胞壁等有形成分沉淀，以上清液为模板进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。GB/T 28642-2012是利用聚合酶链式反应技术建立的饲料中沙门氏菌快速检测的国家标准。 白艳艳等（2008）使用产单核细胞李斯特氏菌hlyA基因设计引物,进行PCR扩增，建立了食品中产单核细胞李斯特氏菌PCR检测方法；该方法的检测限为1×104CFU/mL，人工添加样品的检出限可提高到8 CFU/25 g。

2.2.2.2 多菌种聚合酶链式反应PCR法 样品经过预增菌培养后，增菌液进行沸水浴多目标菌DNA提取，根据多个目标菌分别设计的多对引物，在同一条件下进行DNA扩增；然后用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离测定。SN/T 1869-2007是利用多聚合酶链式反应技术快速检测食品中沙门氏菌、志贺氏菌等9种致病菌的出入境行业标准。蔡亦红和姚余有（2007）使用肠毒性大肠埃希氏菌的LTB、伤寒沙门氏菌的invA和志贺氏菌ipaH编码基因设计出三对不同的引物，建立了3种食源性致病菌多重PCR快速检测方法；检测其灵敏度分别为肠毒性大肠埃希氏菌145 pg/mL、伤寒沙门氏菌100 ng/mL、志贺氏菌7 ng/mL。

2.2.2.3 细菌分子分型MLST法 该方法是在核酸测序的基础上进行细菌分型鉴定的分子生物学分析技术，目前发展很快，生物分辨力极高。主要是通过PCR扩增和测序，对450 bp左右的多个管家基因核心片段序列进行分析，比较等位基因的序列类型，从而达到细菌分类鉴定的目的。所谓管家基因，即所有细胞中均要稳定表达的一类基因，其产物是维持细胞生命活动所必需的，其基因序列高度保守，且在大多数情况下持续表达，又称看家或持家基因。

SN/T 4525.1-2016是出口食品中沙门氏菌的分子分型MLST测定行业标准。该标准根据沙门氏菌470 bp的7个管家基因核心片段的核酸序列设计扩增和测序引物，通过对管家基因片段的扩增和DNA双向测序，得到完整的等位基因序列，将测序结果与MLST数据库进行比对，从而对沙门氏菌进行分子分型鉴定。刘祥等（2015）使用细菌分子分型MLST技术对从畜禽新鲜肉类和副产品肠中分离出来的30株艾伯特埃希菌进行分析测定，通过DNASTAR软件分析和MLST网站数据库比对，发现了艾伯特埃希菌菌株。

2.2.2.4 细菌分子分型SPA基因分型法SPA即葡萄球菌A蛋白，是存在于葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白，是一种单链多肽，具有特异性，绝大多数金黄色葡萄球菌含有SPA。SPA基因的X区含有2～15个长度为21～27 bp的重复序列，由于重复序列数目、特征及排列顺序不同而具有高度的多态性，并且具有重复性好和体内外稳定的特点。根据SPA基因序列设计引物对X区进行扩增，将扩增产物的测序结果与SPA基因分型数据库进行比对分析，从而达到分型鉴定的目的。SN/T 4453-2016进出口行业标准就是根据金黄色葡萄球菌SPA基因序列的特性，采用SPA基因分型技术建立的食品中金黄色葡萄球菌的分子分型SPA基因分型测定的方法标准。李克诚等（2012）采用SPA基因分型技术对浙江省瑞安地区采集的100株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的SPA基因分型进行分析测定，通过与数据库比对发现瑞安地区MRSA的SPA分型以t030和t437为主,并发现了新型菌种t10149。

2.2.2.5 聚合酶链式反应与离子对反相色谱（PCR-DHLC）法PCR-DHLC分析技术是将聚合酶链式反应技术和反相离子色谱仪相结合对DNA核酸片段进行分离检测的方法。核酸片段分子中带负电荷的磷酸根与离子对缓冲溶液TEAA分子中带正电荷的氨基互相吸引，缓冲溶液TEAA分子中的三乙基与分析柱中C18表面的烷基相互吸引，用乙腈进行梯度洗脱，使大小不同的核苷酸片段分离；通过样品吸收峰与阳性对照吸收峰比较，从而达到细菌鉴别的目的。

SN/T 2641-2010出入境行业标准就是利用PCR扩增技术和DNA限制酶切技术，将目标菌DNA切割成大小不等的核苷酸片段，再用DHPLC进行色谱分离，达到了检测食品中沙门氏菌、志贺氏菌等30多种致病菌的目的。陈茹等（2012）建立的多重PCR-DHPLC检测方法能在11种分枝杆菌和23种常见菌中准确鉴别出结核分枝杆菌和牛分枝杆菌，并且具有良好的特异性和灵敏度，检测灵敏度分别为102～103bp和3.6～6.8 fg DNA模板浓度，而且检测时间缩短至1 d。

2.2.2.6 环介导恒温扩增（LAMP）法LAMP法是2000年由日本学者提出的，其针对目标基因的6个区域设计4种特异引物，在60～65℃恒温条件和链置换DNA聚合酶作用下，进行核酸扩增，15～60 min内可以达到109～1010倍的扩增效果，而且操作简单、特异性强。在合成DNA时，从脱氧核糖核苷三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+反应，产生大量白色焦磷酸镁沉淀，不需要仪器设备，肉眼就能判定检测结果。

SN/T 2754.4-2011就是利用环介导恒温核酸扩增技术，根据单核细胞增生李斯特氏菌的特异靶序列virR基因设计两对特殊内外引物，特异性的识别靶序列上6个独立区域的原理，制定的出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检测行业标准。王福厚等（2011）建立的沙门氏菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法，DNA恒温扩增最佳温度为63℃，对沙门氏菌具有良好的特异性，检测限为7～8 CFU／mL，时间短且操作简便。 梅玲玲等（2011）利用其建立的志贺氏菌环介导恒温核酸扩增(LAMP)快速检测方法，对32株不同来源和血清型的志贺氏菌进行测定，结果均为阳性，检测沙门氏菌、大肠杆菌等139株非志贺氏菌株检测结果均为阴性；50批食品的检测结果与传统方法、实时荧光PCR方法结果比较差异不显著；60℃扩增1 h，志贺氏菌的检出限为200 CFU/mL，增菌培养8 h后提高至20 CFU/mL。

环介导等温扩增方法优点：灵敏度高(比传统的PCR方法高2～5个数量级)，反应时间短(30～60 min就能完成反应)，不需要特殊的仪器，操作简单。缺点：操作过程容易形成气溶胶污染，假阳性问题比较严重，引物设计要求比较高，有些基因不适合此法扩增。

2.2.3 核酸杂交技术类 来源不同的双链DNA在体外经加热处理后，解链变性为单链核苷酸，将它们在适当条件下混合在一起，经过退火处理，当两条来源不同，并且存在互补或部分互补的碱基序列的单链核苷酸相遇时，按照碱基互补配对的原则，就可能复性形成新的杂合体DNA。通过测定杂合体DNA分子中的杂交百分率，就能判定两个物种之间亲缘关系的疏密程度，从而达到定性鉴别的目的。

2.2.3.1 实时荧光PCR方法 该方法是在DNA扩增反应体系中加入荧光化学物质，随着扩增循环的增加，扩增产物以指数形式增长，荧光信号不断增强，利用荧光信号的累积作用实时监控整个DNA扩增过程，并根据测定的扩增产物增长曲线的形状和荧光强度进行待测菌的判定。

SN/T 2425-2010是进出口食品中霍乱弧菌快速检测和鉴定的行业标准。该标准采用荧光探针（Taq Man）技术，根据霍乱弧菌溶血素基因、编码O抗原的rfb基因，分别设计了三对各自仅在霍乱弧菌的溶血素基因、rfb基因间保守的特异性引物和三条特异性的荧光双标记探针，实现了对食品中霍乱弧菌的检测和鉴定。张娜娜等（2019）运用其建立的实时荧光定量PCR检测技术，对市场出售的乳酸饮料样品进行嗜酸乳杆菌检测，结果有较好的特异性，绝对灵敏度3 pg，相对灵敏度103CFU/mL。

2.2.3.2 基因芯片法 核酸探针按照有序的行列格式点制在固相支持物上，通过特定温度下与相应样品进行杂交而用于样品中核酸种类定性分析。以试样增菌液提取的DNA作为模板进行多重PCR扩增，扩增产物与载有目标菌核酸探针的基因芯片进行杂交，杂交后用扫描仪对的芯片进行扫描，通过信号值计算结果进行判定。

SN/T 2651-2010出入境行业标准就是利用基因芯片技术，针对沙门氏菌单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌（O157：H7）5种目标菌的保守基因核酸片段设计引物，实现了检测肉及肉制品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌和大肠杆菌（O157：H7）的目的。祝儒刚等（2012）利用多重聚合酶链式反应与基因芯片技术对肉及肉制品中金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌等致病菌进行检测，其建立的基因芯片检测方法可以同时检测上述5种致病菌，且具有良好的特异性，检测限2 pg。陈昱等（2009）应用多重PCR和基因芯片技术对认为污染食品样品中的志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌（O157）进行检测，同时与传统方法进行比对，结果与传统方法一致，检测限为50 CFU/mL，且特异性强，4~5 h内可以完成检测。

2.2.3.3 微滴数字PCR法 试样溶液经过微滴化处理,形成成千上万个纳升级的微滴反应体系，每个反应体系或含或不含待测的核酸靶分子；经PCR扩增、特异性探针杂交后，逐个对微滴进行检测，检测到荧光信号的微滴设为1，为测到荧光信号的设为0，根据泊松分布原理以及阳性微滴的个数与比例就能得到靶分子的起始拷贝数或浓度，从而对目标菌进行测定。

赵新等（2017）利用其建立的沙门氏菌微滴数字PCR的快速定量检测方法与传统国标培养法进行比对试验，结果与传统方法一致，具有较好的特异性，检测 限为1×102CFU/mL。董莲华等（2015）利用其建立的微滴数字PCR检测方法，对猪肉、牛肉、鸡肉样品中的大肠杆菌（O157∶H7）进行检测，O157∶H7基因组DNA反应液浓度在4～1.25×105bp/20 μL内线性最佳，方法的定量限为4 bp/20 μL，检出限为3 bp/20 μL，而且具有良好的特异性。

2.2.4 细胞成分分析技术类 细胞成分分析主要是通过现代化学分析技术气相色谱、液相色谱、质谱等分析仪器设备对微生物细胞表面特征性蛋白质进行分析，从而对致病微生物进行鉴别的技术。

基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）法是细菌全细胞的快速检测技术，主要依据细菌表面特征性蛋白的分子量信息，对细菌进行分类鉴定。将分离的目标菌菌落试样与适量的基质溶液加载在样品板上，使溶剂挥发，形成试样与基质的共结晶，利用激光辐射共结晶，基质分子吸收能量与样品解吸附，并使样品电离成离子态，通过飞行时间检测器，将不同质荷比的离子分开，形成细菌特异性的质谱图。将待测目标菌质谱图在细菌标准蛋白质指纹质谱数据库中进行查找和比较，从而确定细菌的种属，达到微生物鉴定的目的。

SN/T 3872-2014是利用MALDI-TOF MS技术制定出口食品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌四种致病菌快速检测的行业标准。王卫萍等（2015）利用MALDITOF MS方法对临床标本中分离出来的1061株非重复细菌进行测序分析，并与Vitek 2 Compact全自动细菌鉴定系统的鉴定结果进行比较，结果有99.7%的菌株鉴定到属，95.8%的菌株鉴定到种，只有0.3%的菌株未能给出鉴定结果。

3 存在的问题与未来展望

目前，传统方法和现代技术在现行标准中同时并存，传统的鉴别技术具有不可替代的地位，现代技术显示了其简便、快捷、高效的优势。二者同时存在各自的不足，有待进一步发展和完善。

3.1 传统检测方法的缺点 传统检测技术的缺点是操作繁琐复杂、耗时较长、效率低，批量检测受到限制，不符合现代化大生产和现代生活快节奏的要求。以沙门氏菌检测为例，按照传统国标方法检测，试验需要准备13种培养基，并需制成各种平板、斜面、试管等，需要各种试剂30多种，准备这些试验材料时间至少要花费2个工作日；试验过程增菌、分离、生化培养操作时间大约130 h，相当于6 d的时间；生化试验10个，血清学试验3个，各种操作、观察累计也要2个工作日；这样一个样品检测需要至少10 d，并且需要连续工作才能完成（GB/T 13091-2018）。同时，试验对检测人员的素质和技术水平要求很高，需要丰富的实践经验，普通检测人员难以胜任。

3.2 现代快速检测技术的问题和思考 现代快速检测技术的最大不足是对阳性结果不能做出准确判定，需要用传统方法进行确认，不能满足快速检测的需要。免疫识别技术和核酸测定技术一般只能进行单个样品和单个菌株的检测。适用于生产单一产品企业的产品质量控制，但对于检验检测机构的多菌种、大批量检测和快速检测，明显不能满足需要。在目前的现代检测技术中，预增菌和选择性增菌是致病微生物检测不可逾越的重要步骤，也是制约检测时效的关键瓶颈。一般增菌培养时间在18～24 h，甚至48 h或更长。在免疫识别技术中，抗原-抗体反应还有一种捕获和富集目标菌的作用。通过增加称样量，扩大试料中致病微生物的数量,利用免疫磁珠或滤膜技术捕获和富集目标菌，替代传统的预增菌和选择性增菌过程，突破增菌培养的时间限制还需进一步研究。

3.3 未来展望 利用核酸杂交技术、基因芯片技术实现多菌种、大通量检测，充分利用基因技术提高传统微生物鉴别速度和效率，利用免疫捕获和富集技术突破现有增菌培养基的时间限制，实现快速、准确、高效的检测目标。 芯片生物传感器技术也是饲料和食品中的致病菌检测研究的方向之一。通过研究和技术革新，提高生物传感器的选择性、生物响应的稳定性，以及信号检测器和转换器的使用寿命，并使之与计算机技术紧密结合，形成检测、数据采集与处理自动化，进一步提高检测工作效率。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)微生物鉴定技术和基因测序技术有可能突破传统鉴定方法的束缚，成为今后饲料和食品中致病微生物检测技术研究发展的方向。由于现代快速检测技术的不断应用，为了适应新形势的需要，应尽快建立国家细菌鉴定指纹质谱图数据库、分子分型数据库、基因序列图谱数据库等，以满足目前新技术发展的需要。