响应面法优化饲用屎肠球菌QW256增殖培养条件

郭建军， 袁 林， 熊大维， 黄国昌， 曾 静*， 王振希

（1.江西省科学院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.南昌工程学院理学院，江西 南昌 330099）

屎肠球菌（Enterococcus faecium）属于乳酸菌中的肠球菌，革兰氏阳性，需氧或者兼性厌氧菌，菌落呈圆形或者椭圆形，无芽孢和鞭毛，生长迅速，代谢乳酸，通常定植在动物消化道内的回肠和结肠部位，为肠道正常优势菌群（彭众等，2018）。基于其具有耐胃酸、耐热性强、耐药性强等优良生物学特性，可在肠道中形成优势菌群和与肠道表面黏附形成保护屏障，产生有机酸降低肠道pH和一些抗菌物质抑制有害菌，调节肠道微生物菌群平衡，降低腹泻率与死亡率，以及促进反刍动物瘤胃发酵，抑制有害微生物生长，作为抗生素的替代品已被广泛应用于畜牧业生产中（白天天等，2021），有着良好的饲用前景。

高密度培养核心在于为菌体提供合适的营养成分和生长条件，获得较高菌株菌体密度，降低菌株培养成本和缩短生产周期，从而实现高密度、高产率和高浓度培养（聂黔丽等，2021）。不同屎肠球菌菌株对其生长条件存在较大差异，影响其高密培养的因素较多，包括培养基的成分（氮源、碳源、无机盐和生长因子）和基础培养条件（培养温度、初始pH、溶氧浓度）等。实验室前期从健康仔猪肠道内分离筛选得到一株产γ氨基丁酸屎肠球菌QW256，根据兼具益生特性与开发潜力的屎肠球菌QW256的生长需求，从增殖培养基筛选和培养条件2个方面，以活菌数为响应指标，通过单因素试验，Plackett-Burman试验，最陡爬坡试验以及中心组合设计试验与响应面分析法，对屎肠球菌QW256培养条件及培养基组分进行优化，旨在获得最优的培养基配方和适宜的培养条件，为其工业化应用提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株资源 屎肠球菌QW256来自江西省环境微生物与生物技术重点实验室。

1.1.2 培养基MRS液体培养基：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物8 g/L、牛肉膏5 g/L、乙酸钠5 g/L、柠檬酸三铵2 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、吐 温-80 1 mL/L、MnSO4·H2O 0.058 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 6.2~6.4。固体培养基添加琼脂20 g/L。

发酵培养基：在MRS培养基基础上，改变碳源、氮源、无机盐等，各成分的量随试验设计的变化而不同。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株培养 将屎肠球菌QW256甘油保存管于MRS培养基上划线活化，37℃培养24 h；挑取单菌落接种至MRS液体培养基中，37℃、120 r/min培养16 h后获得种子液。发酵培养基成分根据试验方案逐次改变，向发酵培养基中接入3%的种子液，37℃发酵培养24 h，测活菌数。参照国标GB 4789.35—2016按照MRS琼脂平板倾注法检测活菌数。

1.2.2 单因素试验 培养条件的优化：接种量、培养温度和发酵初始pH是影响乳酸肠球菌高活菌数培养的重要因素。取种子液以一定的接种量转接到有300 mL MRS培养基的500 mL蓝口瓶中，一定温度下于120 r/min培养20 h后测定发酵液的活菌数和pH，依次考察不同接种量（1%、3%、5%、7%、9%）、不同培养温度（30、32、35、37、40、42℃）和不同初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）对菌活菌数的影响。

发酵培养基组分优化：分别以20 g/L葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖浆、玉米淀粉和糖蜜等替代MRS培养基中的碳源，在已优化培养条件下培养20 h，以活菌数为考察指标，确定碳源。在筛选出最佳碳源基础上，考察碳源添加量（5、10、15、20、30、40 g/L）对菌株生长的影响；然后依次考察不同氮源种类（酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、玉米浆、黄豆饼粉和硫酸铵）、不同类别缓冲盐体系（柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐等）、微量元素、促生长因子对菌株生长状况的影响。

1.2.3 Plackett-Burman设计 在前期单因素试验的基础上，选高低2个水平，以（-1、1）编码各值，其中高水平是低水平的1.5倍，以培养后发酵液活菌数为响应值进行试验分析，计算各因素效应和重要性评价，筛选出对屎肠球菌发酵液活菌数具有显著性影响的因素。

1.2.4 最陡爬坡试验 根据PB试验结果设定各因素的步长及变化方向进行试验，使其成梯度变化，检测各个梯度下发酵液活菌数，逼近最佳区域，确定下一步中心组合设计试验中因素的中心点。

1.2.5 中心组合设计试验 根据最陡爬坡试验找出试验的显著因素与水平，显著因素响应区域的中心点为零水平，采用Box-Behnken中心组合设计，设计3因素5水平的响应面分析试验并对数据进行处理，每组重复3次，取平均值作为试验结果。

1.3 数据处理与统计分析 所有试验均重复3次，结果以“平均值±标准偏差”表示。通过Design-Expert 8.0.6软件对回归模型进行方差分析和可靠性分析。

2 结果与分析

2.1 培养条件对菌株屎肠球菌QW256生长的影响 由图1B可知，随着接种量的增加，屎肠球菌QW256菌株生长培养发酵液活菌数呈现先升高后降低的趋势，接种量为5%时活菌数达到最大值，因此选择5%为最适接种量。由图1C可知，当培养温度为29～37℃时，随着温度的升高活菌数逐渐升高；当发酵温度高于39℃之后，活菌数迅速下降。因此，最佳发酵温度为37℃。由图1D可知，随着MRS初始pH的升高，发酵液活菌数呈先升高后降低的趋势，在初始pH为7.0时，活菌数达到最高；但初始pH为6.5～7.5时，活菌数没有显著区别，因此，选择初始pH为7.0。

图1 不同培养条件对菌株屎肠球菌QW256生长的影响

2.2 增殖发酵培养基组分对菌株屎肠球菌QW256生长的影响

2.2.1 不同碳氮源对菌株屎肠球菌QW256生长的影响 培养基中碳源和氮源成分及其适宜添加量的选择是改善乳酸菌生长的手段。在以MRS为基本培养基上，改变碳源、氮源，进而筛选合适屎肠球菌QW256生长的碳源和氮源。本着工业生产成本最低化原则，筛选发酵乳酸菌常用到的碳氮源，结果见表1。

表1 不同碳氮源对菌株屎肠球菌QW256生长的影响

由表1可知，屎肠球菌QW256在以葡萄糖为碳源的培养基内生长较好，发酵后活菌数最高，为9.16×108CFU/mL，与 糖 蜜试验组9.10×108CFU/mL无显著差异（P＞0.05），二者与其余各组存在显著差异（P＜0.05），说明屎肠球菌QW256比较适合在以葡萄糖或糖蜜为碳源的培养基内生长。综合考虑工业生产成本选择糖蜜作为碳源进行下一步研究。

屎肠球菌QW256在以酵母粉和玉米浆为单一氮源时发酵液活菌数明显高于其他试验组（P＜0.05），酵母提取物和玉米浆试验组间不存在显著性差异（P＞0.05）；以酵母粉和玉米浆为屎肠球菌QW256生长氮源进行复配优化时，酵母提取物和玉米浆以1∶2比例复配时发酵液活菌数达到最大，显著高于其他试验组（P＜0.05）。

2.2.2 缓冲盐体系和微量元素对菌株屎肠球菌QW256生长的影响 由表2可知，柠檬酸-柠檬酸钠试验组发酵液活菌数显著高于其他试验组（P＜0.05），其他组与MRS对照组不存在显著性差异（P＞0.05），表明柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系能够在一定程度上促进屎肠球菌QW256菌体增殖；微量元素通常作为酶或者活性物质的组成部分或者激活剂发挥作用，发现培养基内加入精氨酸、Mg2+对屎肠球菌生长有促进效果，故在优化培养基选择加入硫酸镁和精氨酸。

表2 缓冲盐体系和微量元素对菌株屎肠球菌QW256生长的影响

以碳源及氮源的结果得到初优培养基：糖蜜20 g/L、酵母粉8 g/L、玉米浆16 g/L。通过培养基中其他营养物质试验结果及乳酸肠球菌生长特点的分析，确定柠檬酸0.25 g/L、柠檬酸钠4.5 g/L、硫酸镁0.6 g/L及精氨酸0.2 g/L添加到初优培养基进行PB试验。

2.3 两水平部分因子设计筛选影响屎肠球菌QW256生长的主要影响因子 以屎肠球菌QW256活菌含量（108CFU/mL）为响应值进行Plackett-Burman试验设计，试验设计方案及结果见表3。对试验结果分析，得到回归模型方差分析和各因素的主效应见表4。

表3 PB试验设计及结果

由表4可知，该模型的决定系数为96.52%，校正后的决定系数91.36%＞70%，并且模型的P值为0.0033，证明模型与实际情况拟合较好。糖蜜、酵母粉、柠檬酸、柠檬酸钠、硫酸镁、接种量和初始pH为正效应，选择它们的高水平应用到后续试验中；玉米浆、精氨酸、培养温度为负效应，选择它们的低水平应用到后续试验中。从P值来看，糖蜜在置信区间P<0.01影响显著，柠檬酸钠和初始pH在置信区间0.01

表4 PB试验各因素主效应分析结果

2.4 最陡爬坡试验确定响应面最优邻域 根据Plackett-Burman试验的结果发现糖蜜、柠檬酸钠和初始pH因素都呈显著正效应，变化方向为各因素浓度梯度递增，进行最速上升试验。表5的结果表明，最大活菌数在第4次试验附近，故采用糖蜜22.5 g/L，柠檬酸钠4.9 g/L，初始pH 7.6进行后续工艺优化试验。

表5 最速上升试验设计及结果

2.5 中心组合设计优化屎肠球菌QW256生长的关键因子 以糖蜜、柠檬酸钠和初始pH 3个显著影响因子作为响应面设计的自变量，以培养后发酵液活菌数作为响应值进行中心组合设计3因素5水平的Box-Behnken试验，试验设计和结果如表6所示。

表6 屎肠球菌QW256增殖条件优化中心组合试验设计及结果

由Design-Expert 8.0.6软件拟合得到多元回归模型，试验因子对响应值的影响可用回归方程表 示 为：R=-469.986-0.995X1+14.443X2+117.19X3+0.334X1X2+0.312X1X3+3.682X2X3-0.063X12-4.978X22-9.252X32，回归方程的参数估计和方差分析见表7。

表7 中心组合试验回归模型的方差分析

由表7可知，调整确定系数R2adj=0.8703与确定系数值R2=0.9211较为接近，表明该模型活菌数的预测值和试验值之间的拟合度良好；精密度Adeq Precision=8.379>4，说明该模型响应信号强，可用于拟合上述试验结果，CV=1.59%，说明总变异中只有1.59%不能用此模型进行解释，不能拟合情况可以忽略；二次多项式模型P值为0.0089，极显著（P<0.01），失拟项的P值为0.2774（P>0.1），差异不显著，说明该模型能够涵盖所有试验数据，试验精确度强及可信度高，可以用该模型对试验结果进行分析及预测最大值。

2.6 响应曲面分析确定最佳浓度及验证试验由图2可见，响应面三维立体图均为光滑的曲面，且开口向下，X1、X2、X3存在极值点，说明区域在所设计的响应面范围覆盖了最大值，能够找到活菌数的最大值，响应面立体图曲线较为弯曲，说明因素两两之间交互作用显著，各因素对结果影响较大；使用Goal Maximize命令对R进行岭脊分析，当3个因子最优试验点（X1、X2、X3）的代码值（0.87、0.52、0.76）时，得出回归模型存在的最大估计值为：活菌数最大值为1.073×1010CFU/mL，即与其对应的是糖蜜24.7 g/L，柠檬酸钠5.1g/L，初始pH 7.7。

图2 各因素交互作用响应面图

为了验证最优屎肠球菌QW256生长条件和过程工艺参数的控制主要包括对发酵温度、发酵时间、接种量、培养基pH的调控，本试验中屎肠球菌QW256的最佳接种量为5%、最适培养温度为37℃、最适初始pH为7.7。

为了验证最优屎肠球菌QW256生长条件和增菌效果的可靠性，按照优化后的条件，以初始MRS培养基为对照进行验证试验，其活菌含量、发酵液pH的变化曲线结果如图3所示。屎肠球菌QW256在MRS和优化培养基中的生长曲线可以看出，延迟期由7 h提前到3 h，稳定期由18 h提前到14 h，对数生长期延长了2 h，整个发酵培养周期时间缩减3 h，证明优化后的培养基更加有利于菌株屎肠球菌QW256的生长：整个生长周期中MRS培养基的最大活菌浓度为3.36×109CFU/mL，优化培养基最大活菌浓度为1.12×1010CFU/mL，与模型预测值非常接近，表明该模型能很好地预测实际的发酵情况。而pH变化曲线可以看出，pH在对数期时下降速率较快，菌体增殖产生的大量有机酸的速率增加较快，且与细胞生长呈现相关性。

图3 屎肠球菌QW256的生长曲线

3 讨论

乳酸菌菌剂制备的关键在于其高密度培养，影响高密度培养的因素有菌种特性、培养基成分、培养过程工艺参数的控制以及培养模式等，增菌培养基的优化是高密度培养的基础。乳酸肠球菌的营养要求复杂，通过培养基的改良或额外添加营养物质（如氨基酸、核苷酸、维生素等），并且需要营养物质浓度恰当合理，才能有效促进菌体增殖。本试验中，在以MRS为培养基 的基础上进行改良与添加营养物质，以糖蜜为碳源、酵母粉和玉米浆为氮源、柠檬酸钠盐为缓冲盐体系、营养因子（精氨酸）等营养物质作为屎肠球菌QW256培养基时，缓解发酵液pH降低对菌株生长的抑制作用，延长菌体对数生长期，获得较高的生物量。培养过程工艺参数的控制主要包括对发酵温度、发酵时间、接种量、培养基pH的调控，本试验中屎肠球菌QW256的最佳接种量为5%、最适培养温度为37℃、最适初始pH为7.7。

本试验在MRS培养基的基础上进行单因素试验，确定适合该屎肠球菌生长的最优培养工艺参数（接种量、培养温度、培养时间等），以及该菌的最适培养基成分（碳源、氮源、缓冲盐体系、生长因子、微量元素等）；通过Plackett-Burman试验设计分析筛选影响屎肠球菌发酵活菌数的显著影响因子，利用最陡爬坡试验逼近显著因子的最大活菌数响应区域，最后采用中心组合试验设计和响应面分析法得到显著影响因子的最优配比。本试验通过优化屎肠球菌QW256培养基及培养条件，在最佳条件下进行发酵培养得到的活菌数为1.12×1010CFU/mL，高于陈志娜等（2021）高密度培养屎肠球菌R2后的活菌数1.33×109CFU/mL和采用单因素及响应面试验对屎肠球菌Y1增殖培养条件及培养基进行优化得到活菌数2.90×109CFU/mL（苑园园等，2021）。

4 结论

本研究以工业化生产为出发点，采用单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验、中心组合设计试验以及响应面分析对屎肠球菌QW256培养条件和高密度培养基配方进行优化，确定菌株屎肠球菌QW256的最佳增殖培养条件为接种量5%、培养温度37℃、初始pH 7.8，菌株屎肠球菌QW256优化培养基成分为：糖蜜24.7 g/L、酵母粉10 g/L、玉米浆16 g/L、柠檬酸0.25 g/L、柠檬酸钠5.1 g/L、硫酸镁0.6 g/L及精氨酸0.2 g/L。在优化后培养条件下培养17 h时发酵液活菌数为1.12×1010CFU/mL。