基于宏基因测序的微生物饲料添加剂菌群结构及质量分析

李 明，饶正华，梁洺源，张军民

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所中心实验室，北京 100193）

随着饲料端全面禁抗，养殖端进入减抗、限抗时代，微生物饲料添加剂产业迎来了新的机遇。但是由于在生产过程中控制不严，其他微生物的污染问题成为影响产品质量的重要安全隐患。目前，对微生物饲料添加剂产品中污染菌，如沙门氏菌、大肠菌群、葡萄球菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌等的检测，主要用平板计数、最大或然计数法等常规方法，这些方法都是有明确的检测目标，而对于非目标，却往往无法检出。如果要全面了解产品中菌的情况，需要对每种菌都进行检测；细菌总数、霉菌总数等也只是一个相对的概念并且不能进行分类。因此，常规分析方法不仅费时费力，而且不能全面分析产品中的菌群和含量。

宏基因组学技术是基于生境中所有微生物总DNA序列，分析其菌群结构的重要检测方法，可全面分析样品中含有的微生物种类和其相对含量，被广泛应用于食品（Li等，2020；Huang等，2017；Coughlan等，2015）、环境（Zhou等，2021；Schages等，2021；Nagarkar等，2021）、 肠 道（Chaitra等，2021；Wang等，2020a；Wang等，2020b）等。本研究利用宏基因组学技术对4年采集的113个微生物饲料添加剂样品进行菌群结构分析，旨在阐明微生物饲料添加剂产品目前存在的问题、污染频率较高的微生物、生产中引起微生物污染风险的关键环节及应对策略，为微生物饲料添加剂产品的质量控制和行业监管提供数据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 研究对象 本试验的研究对象为2018年至2021年采集的市售微生物饲料添加剂，共113个样品。

1.1.2 主要试剂及仪器DNA提取试剂：参照Yu等（2004）方法自行配制；文库构建试剂盒Tn5 DNA Library Prep Kit for Illumina，北京全式金生物技术有限公司。

Thermo微量移液器、5810R小型台式冷冻离心机，德国Eppendorf公司；GR 60DA高压灭菌锅，致微（厦门）仪器有限公司；Qubit 3.0核酸荧光定量仪，美国ThermoFisher Scientific公司；Illumina Hiseq 3000基因测序平台，美国Illumina公司。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取 取0.05 g样品于离心管中，加入5~20粒氧化锆珠和1 mL的裂解液，振荡研磨仪振荡3 min。70℃水浴15 min。12000 r/min离心15 min，转移上清液至新的离心管，加入10 μL的RNA酶A溶液，37℃孵育15 min。加入20 μL的蛋白酶K溶液，70℃孵育10 min。加入200 μL的PEG溶液和100 μL的核酸吸附磁珠悬液，室温静置10 min，磁力架静置吸附1 min，弃上清液。70%的乙醇漂洗2次。加入100 μL的纯水洗脱DNA。Qubit 3.0核酸荧光定量仪检测DNA的浓度，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整度。

1.2.2 宏基因组文库构建与测序 利用全式金建库试剂盒，按照说明书进行文库制备。Illumina Hiseq 3000测序平台（北京贝瑞和康生物技术有限公司）进行宏基因组测序。

1.2.3 下机数据质控 利用fastp v0.12.4（Chen等，2018）对宏基因组下机数据进行质控，删除N碱基含量超过10%或Q值小于5的碱基超过50%的序列。

1.2.4 物种注释和定量 利用Kraken2 v2.0.8（Wood等，2019）将质控后的数据与Kraken数据库进行序列比对，完成种属分类。利用Bracken v2.5（Lu等，2017）对注释结果进行统计，计算每种微生物的相对含量。

2 结果

2.1 菌群结构分析 通过对113个微生物饲料添加剂样品进行菌群结构分析，即分析样品中包含的菌种及其相对含量，发现产品主要存在检测菌种与标识不符、使用《饲料添加剂品种目录》（以下简称《目录》）外功能菌、目标菌含量偏低、部分产品存在杂菌甚至致病菌的问题。

2.1.1 菌种与产品标识不符 如图1所示，编号23产品的菌群结构主要为74.59%的副地衣芽孢杆菌、17.22%的卷曲乳杆菌和3.14%的地衣芽孢杆菌。其产品标识的菌种为地衣芽孢杆菌，说明该产品使用的菌种与标识不符。

图1 编号23产品的菌群结构

2.1.2 使用《目录》外功能菌 如图2所示，编号95产品的菌群结构主要为35.39%的贝莱斯芽孢杆菌、30.59%的解淀粉芽孢杆菌、15.89%的枯草芽孢杆菌、6.13%的萎缩芽孢杆菌、2.86%的芽孢杆菌Lzh-5和2.4%的芽孢杆菌病毒Φ29。值得注意的是，贝莱斯芽孢杆菌具有生物降解功能（Deng等，2022；Liu等，2022；Ullah等，2021）和 抑 菌 作 用（Zhang等，2021a；Yan等，2021a；Wang等，2021a），解淀粉芽孢杆菌更多的报道为产生抗菌成分（Yan等，2021b；Yan等，2021c；Wang等，2021b）与治疗致病菌引起的动植物疾病（Zhang等，2021b；Wang等，2021c；Wang等，2021d），属于药用范畴，而这两种菌是否具有提高动物生产性能的作用，却鲜有报道，因此，这两种菌并未纳入《目录》中。如认为添加属于利用菌种的抗菌作用，则等同于直接向样品中添加抗生素。

图2 编号95产品的菌群结构

2.1.3 非致病菌污染 如图3所示，编号71产品的菌群结构主要为戊糖片球菌、Y-01芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、IHB B 7164芽孢杆菌和屎肠球菌。其产品标识的菌种为戊糖片球菌，仅占34.26%，说明该产品标识菌的含量偏低。

图3 编号71产品的菌群结构

2.1.4 致病菌污染 如图4所示，编号43产品的菌群结构主要为地衣芽孢杆菌、卷曲乳杆菌、屎肠球菌、肺炎克雷伯菌、戊糖片球菌和棒状乳杆菌。其中，肺炎克雷伯菌是一种常见的致病菌，说明该产品含有致病菌，存在致病性风险。

图4 编号43产品的菌群结构

2.2 污染菌的统计学分析 通过对113个微生物饲料添加剂样品进行污染菌的统计学分析，如表1所示，目前市售微生物饲料添加剂出现频率较高的污染菌分别为贝莱斯芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、副地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、解淀粉芽孢杆菌和卷曲乳杆菌。其中，贝莱斯芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌的污染频率最高，占比12.82%。

表1 样品中高频污染菌

3 结论

本研究结果表明，利用宏基因学技术检测微生物饲料添加剂的菌群结构，可有效检测微生物饲料添加剂中的非靶向污染菌，使污染菌甚至致病菌通过一次实验高通量检出，克服了传统靶向检测方法只能检测一种或一类特定培养条件的微生物的缺点。对微生物饲料添加剂产品的质量控制和行业监管具有重要参考意义。

4年持续分析的结果表明，微生物饲料添加剂产品存在检测菌种与标识不符、目标菌含量偏低、部分产品存在杂菌甚至致病菌的问题。