叶蛋白提取与应用的研究进展

史 可， 李研东， 王成祥， 霍惠玲， 高 山， 马晓迪， 李丹丹， 韩 雪*

（1.河北科技大学食品与生物学院，河北 石家庄 050018；2.河北省兽药饲料工作总站，河北 石家庄 050035；3.河北省健康主食产业技术研究院，河北 石家庄 051430；4.河北同福健康产业有限公司，河北 石家庄 051430）

叶蛋白是以绿色植物的茎叶为提取原料，经压榨、浸提、蛋白质分离和浓缩干燥等步骤制备的蛋白质浓缩物（LPC）（高琦等，2020）。主要由叶绿体内基质蛋白和细胞质蛋白等组成，属于“功能性蛋白质”（刘晓庚等，1999）。当前，大约有60多种植物茎叶可用于叶蛋白的提取，紫花苜蓿、桑叶、黑麦草、紫云英是研究与应用的常见种类（表1）。叶蛋白作为一类优质的蛋白质资源，其广泛应用于食品、饲料、医疗等行业，可有效地缓解我国人均蛋白质摄入量不足的问题。近年来，叶蛋白研究多集中在提取方法优化和复合功能性物质分析等方面，并且研究内容逐渐深入。本文主要从叶蛋白的营养价值、提取方法、应用前景等方面概述其研究进展。

表1 常见叶蛋白的蛋白质含量及其应用

1 叶蛋白的营养价值

叶蛋白是绿叶植物中所特有的蛋白质，是在叶中形成的初始蛋白，与经过茎叶输送、累积到籽实中的蛋白质相比，蛋白质的分子链更短，易于人体的消化吸收。其粗蛋白质含量一般可达30%~60%，所含氨基酸种类齐全，比例均衡，包含人体所需的8种必需氨基酸，且含量均较高。从营养学角度来看，几乎完全符合联合国粮农组织/世界卫生组织（FAO/WHO）推荐的人体需要的氨基酸模式。

除蛋白质外，叶蛋白还含有许多营养物质，如胡萝卜素、叶黄素、维生素及多种矿物质元素等，具有抗氧化、促进消化吸收、降低胆固醇等功效。如西兰花茎叶蛋白肽具有较好的降血脂活性（李露等，2019）。鲁梅克斯叶蛋白酶解物具有一定的抗氧化效果，食用后可有效清除体内的自由基，减少自由基带来的氧化损伤（李延琪等，2017）。且绿叶中含丰富的不饱和脂肪酸，非常符合人们当下的饮食理念。现我国已有研究采用一系列方法来制备其水解物，优化制备条件并进行成分分析，为叶蛋白资源的开发利用和精深加工提供实验依据和技术参考。

2 叶蛋白的提取方法

植物体内的天然蛋白质一般稳定性都比较强，即使植物受到了一定的破坏，也不会对蛋白质的结构造成影响。在进行叶蛋白的提取之前，需要通过压榨、酶法等手段破坏其稳定状态，利用离心等多种方式实现蛋白质的沉淀，从而为后期的研究和应用提供条件（于群，2019）。目前用到的叶蛋白提取方法有很多，针对不同的叶蛋白需要采取不同的提取方式，在提取过程中一定要综合考虑多种影响因素，选用合理的提取方法。

2.1 直接加热法 直接加热法是指蛋白质在高温环境下受热沉淀而提取蛋白质的方法。工艺流程图如下：

该方法操作简单易行，成本低，但是温度过高会破坏蛋白质的结构使其变性，可能会降低蛋白质的活性以及提取率。吕富（2013）利用50~90℃逐渐升温的加热法提取水葫芦叶蛋白，发现随着温度的升高，其叶蛋白得率不断提高，50~70℃时升高幅度较大，70℃后叶蛋白得率不再升高，考虑到经济效率与叶蛋白得率，提取温度70~80℃最为适宜，叶蛋白得率可达1.52%，提供了一种水葫芦叶蛋白提取的可行性方法。

2.2 酸（碱）化加热法 酸（碱）化加热法是将酸碱法和加热法相结合的一种复合蛋白质分离方法，在等电点和热变性双重因素的作用下，叶片蛋白质的聚集效应和敏感性提高，导致叶片蛋白质快速聚集。工艺流程图如下：

该方法蛋白质沉淀快、过滤收集较方便，但化学试剂会在一定程度上损害叶蛋白的营养成分，并对环境造成一定的影响。研究发现以酸化加热法来提取红萍叶、木薯叶、黑麦草、构树叶、籽粒苋、黄麻等的叶蛋白效果较好（岑湘涛等，2020；杨有泉等，2013），提取率一般可达30%以上，提取效率高，但操作较繁杂，适用于实验室提取。而碱化加热法适用于提取含有大量等电点偏碱性的叶蛋白（王震等，2016），可以有效减少叶蛋白中的不利因子，并对叶黄素的稳定性有一定的保护作用；但一定程度上破坏了叶蛋白的结构，品质较差。这表明在制备叶蛋白时，需要根据想要得到的功能性质和实际应用选择合适的提取工艺。

2.3 盐析法 盐析法是利用各物质在不同盐溶液中的溶解度不同而沉淀析出。常用的中性盐有硫酸铵、氯化钠等，工艺流程图如下：

该方法可在室温下进行，操作简单、成本较低，且可以较好的保持蛋白质的活性。但是整个提取过程耗时较长、效率低。陈秀清（2017）通过正交试验优化不同方法提取南美蟛蜞菊叶蛋白的条件，结果表明盐析法提取南美蟛蜞菊叶蛋白的得率最高，很好的保持了叶蛋白的活性，且适用于工业化和实验室应用。杨豪（2021）通过硫酸铵沉淀法提取辣木叶蛋白，优化其提取条件，提取率可达13.49 mg/g。

2.4 发酵法 发酵法是利用菌种发酵液中的酸效应作为蛋白质沉淀剂使蛋白质提取液中的蛋白沉淀，通过离心分离得到粗蛋白质。工艺流程图如下：

该方法不会产生有害物质，可以有效的减少环境污染，且发酵液中含有大量的微生物和生物活性大分子，如酶、菌肽、细菌素等，促进了其聚集作用，同时在一定程度上可降低粗蛋白质中有害物质的含量。但发酵时间较长，如果要大规模生产，就要求企业配备发酵设备，生产成本较高。屈红森（2012）利用响应面优化枯草芽孢杆菌发酵法提取桑叶蛋白的条件，桑叶蛋白得率和蛋白质含量分别提高了10.57%和21.53%，且发酵后桑叶蛋白的体外消化能力也得到了显著提高，桑叶蛋白的品质得到改善。

2.5 超声波辅助法 超声波辅助法是利用超声波产生的空化、振动、粉碎、搅拌等辅以其他方法提取叶蛋白，加快蛋白的溶出，有效减少提取时间，提高提取效率，常与其他方法联用。工艺流程图如下：

有研究表明，超声波辅助提取叶蛋白在蛋白质产量上优于非超声法，且增强了蛋白质的乳化性、发泡性、吸油性、热稳定性等功能特性（Saha等，2017）。许英一（2013）在碱法提取苜蓿叶蛋白基础上加以超声波辅助，并对工艺条件进行优化，粗蛋白质提取率可达51.09%，提高了提取率，并大大缩短了提取时间。职士淇（2020）应用超声波辅助碱溶液、盐溶液和水溶液提取苎麻叶蛋白的起泡性优于大豆分离蛋白，且超声波辅助盐提法提取率可达61.95%，为青叶苎麻叶的开发利用提供更多的理论依据。

2.6 其他 目前，提取叶蛋白的方法除了以上所提到的还有泡沫分离法、微波辅助法、酶辅助法、超高压等，但由于这些方法有能耗大、不易操作、效率低等局限性，在实验室和工业化生产中应用较少。刘龙（2017）以回收率和富集比为指标，利用泡沫分离技术提取菠菜叶中的蛋白质，并优化其提取条件，回收率和富集比可达81.56%、14.94。证明了泡沫分离技术是一种实现菠菜叶蛋白粗分离的有效的、低成本的方法，但是大多适用于低浓度，具有表面活性物质的分离提取。有关菠菜叶蛋白功能性质的改善及高浓度下的泡沫分离技术还需要进一步研究。Moreno-Nájera（2020）利用超声波辅助、微波辅助、超高压等技术提取菠萝蜜叶蛋白，发现以0.5 mol/L NaCl为环境友好溶剂的超高压法可获得较高的蛋白质得率，提供了一系列绿色技术提取蛋白的可能性。

3 应用前景

3.1 饲用价值 植物叶蛋白广泛应用于饲料生产，有效缓解了我国饲料行业资源短缺的现状，改善了饲料的营养价值。我国的研究工作主要集中在苜蓿、黑麦草、桑叶等，均可简单加工为优质蛋白饲料饲喂动物，也可作为添加剂加入到饲料中提高其营养价值。比如苜蓿、木薯叶蛋白富含各类氨基酸，可满足动物的营养需求。不仅成本低，且提高了作物的附加值。食叶草也是近年来出现的一种蛋白质新资源，蛋白质含量高，氨基酸种类较为丰富，能够满足动物的生长需求，有巨大的发展前景。例如，饲料中添加浓缩苜蓿叶蛋白不仅可以提高饲料中蛋白质含量，也提高了牛奶中高纯度多不饱和脂肪酸的氧化稳定性，利用此方法提高牛奶抗氧化水平来减少氧化（Fauteux等，2016）。范利花（2012）提取柠条叶蛋白后产生的残渣采用混菌发酵，得到的发酵饲料是一种品质良好的动物饲料。整个过程操作简单、成本低廉，改变了柠条的传统利用方式。

3.2 食用价值 当今时代，人们逐渐意识到膳食结构对于身体健康的重要性，这导致叶蛋白作为原料在肉类替代品、乳制品类似物、休闲食品等产品中被广泛应用。目前，已经出现了很多叶蛋白延伸产品，以及将提取所得叶蛋白以添加剂的方式应用于食品中，用以提高食品的营养价值，改善人们的膳食结构。如以小麦、绿豆和大米为原料，添加用杂交苋、辣木和白银合欢3种不同叶片为材料制备混合叶蛋白浓缩物LPC制成断奶食品。使食物更有营养，从而解决营养不良问题（Meda等，2017）。

3.3 医用价值 除却用作动物饲料与食品，很多叶蛋白表现出抑菌、防癌、降血脂等功效，对医疗行业的发展有一定的推动作用。近年来，研究将视线聚焦于叶蛋白内功能性物质的提取并对蛋白进行改性，研究其作用机制及其应用。如桑叶蛋白水解物通过整合肠道菌群和免疫功能来缓解结肠炎，维持肠道健康，降低结肠炎的风险（Sun等，2021）；苜蓿叶蛋白及其水解肽具有一定的抗氧化活性，同时具有降血脂、抗衰老、增强免疫力等功能，已有研究者采用一些小分子糖类物质对苜蓿叶蛋白进行糖基化改性，有效改善了苜蓿叶蛋白的功能特性，拓宽了其应用范围；辣木叶蛋白对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠具有降血糖和抗氧化作用，对小鼠无急性毒性，是一种很有前途的糖尿病替代或补充药物（Paula等，2017）。

4 结束语

叶蛋白来源广泛，营养丰富。近年来对于叶蛋白的研究，提高了作物的附加值，最大程度上利用了作物资源，缓解了我国蛋白资源短缺的现状，进一步完善优化了国民膳食结构。目前已有很多提取叶蛋白的方法，提取率在逐渐提升，但大多仅限于实验室应用，产业化应用方法比较局限，仍然需要进一步研究产业化生产中如何降低原料成本和能耗，提高提取效率。且大部分叶蛋白制品普遍为深绿色或棕色，有一定青草味，颜色和口感均限制了其应用范围及商业价值。现在常用到吸附法、有机溶剂和超临界CO2流体萃取技术等进行脱色，获取高品质叶蛋白。采用有机溶剂法脱色分离对溶剂消耗量大，成本较高；而超临界CO2流体萃取以CO2为萃取剂，设备投资较高。现用的提取和脱色方法均存在一定的缺陷，且在加工过程中如何最大限度保护维生素、活性物质等有效成分，去除叶蛋白制品中的抗营养物质和毒素，保证叶蛋白的营养性和安全性是有待解决的问题。因此探索低成本、安全、高效的提取和脱色方法是获取高品质叶蛋白的必要途径。