石斛多糖延缓秀丽隐杆线虫衰老的研究

李海春 廖思艺 田贵丰 许吉安 刘 伟 黄九九*

（1华南农业大学生命科学学院，广东广州 510642；2广州市博藤贸易有限公司，广东广州 510000；3广州蜜妆生物科技有限公司，广东广州 510000）

石斛属（Dendrobium）植物为兰科（Orchidaceae）附生珍稀濒危物种，为中国传统名贵中药材[1]。石斛茎中含有丰富的植物多糖，具有滋养皮肤、降低血糖、抗肿瘤、提高免疫力及延缓衰老等功效，素有“药中黄金”之美称[2]。对于石斛多糖滋养皮肤、降低血糖、抗肿瘤、提高免疫力等功能的研究多有报道[2-5]，但其延缓衰老功能及可能的作用机理尚缺乏试验依据。

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是一种无毒无害、可以独立生存的线虫，其遗传背景清楚、个体结构简单、生命周期短、基因组测序完成、进化过程中高度保守、与人类的基因同源性高达60%～80%，且培养条件简单、易于操作，为国际上公认的分子生物学和发育生物学研究的首选模式生物，目前被广泛应用于分子遗传学、发育生物学、神经科学和细胞生物学等领域[6-8]。

本文选取多糖含量丰富的铁皮石斛、鼓槌石斛、细茎石斛为研究对象，对石斛多糖影响秀丽隐杆线虫的寿命、产卵量、运动行为和热应激能力等进行了研究，旨在探讨石斛多糖延缓衰老的作用机理，以期为更好地开发利用石斛多糖提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）、细茎石斛（Dendrobium moniliforme （L.） Sw.）、鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum Lindl.），取自华南农业大学植物种质保护与利用研究中心的温室大棚。

雌雄同体的N2野生型秀丽隐杆线虫、尿嘧啶合成缺陷型大肠杆菌菌株E.coli OP50，均由华南农业大学食品学院提供。

1.2 试验设计

取铁皮石斛、细茎石斛、鼓槌石斛3个石斛品种，分别从中提取石斛多糖[9]。每个石斛品种均配置成浓度为0.4、0.8、1.6 mg/mL的石斛多糖溶液，分别取 5 μL，并加入 E.coli OP50 菌液 95 μL，混匀后涂于NGM平板上。得到石斛多糖最终浓度分别为20、40、80 mg/L，对照组添加相应量的无菌水。

1.3 试验方法

1.3.1 E.coli OP50培养。挑取E.coli OP50单菌落至10 mL LB液体培养基中，于37℃、200 r/min条件下振荡培养至OD600为0.4～0.6。

1.3.2 秀丽隐杆线虫的复苏和培养。取秀丽隐杆线虫冻存管于37℃水浴解冻，以1500r/min离心1min，弃上清液，沉淀转移到涂布E.coli OP50的线虫培养基（NGM）的菌苔外缘，于20℃培养。

1.3.3 秀丽隐杆线虫的同期化处理。将处于产卵期的雌雄同体的线虫用无菌M9溶液冲洗转移至EP管，加入等量高氯酸钠裂解液充分混匀后离心，沉淀用M9溶液清洗2～3次至pH值7.0，取虫卵滴于含E.coli OP50的NGM平板上20℃恒温培养，约48 h后，线虫的受精卵发育至L4期，完成同期化处理。

1.4 指标测定

1.4.1 寿命测定。取同期化的线虫，记为本次试验的第0天，20℃恒温培养，每天将存活的线虫转移到新NGM培养板，记录线虫的死亡数量和存活数量，每组测定50条，重复3次。线虫无移动、吞咽动作且用铂丝轻触虫体无任何反应视为死亡，最后一条线虫死亡的时间为该组线虫的最长寿命[10]。

1.4.2 产卵量测定。取同期化的线虫，每个NGM平板放置1条，每隔24 h转移到新NGM培养板，待线虫不再产卵后将所有NGM平板继续于20℃恒温培养。子代线虫孵化长大后进入产卵期之前对线虫进行计数，即为该线虫的产卵量[11]，每组测定50条，重复3次。

1.4.3 头部摆动频率测定。挑取状态相当的同期化线虫，放置在无大肠杆菌的NGM平板上，记录1 min内线虫头部摆动的次数，每组测定50条，重复3次。一次头部摆动是指线虫的头部从一个方向摆向另一个方向后又摆回来[12]。

1.4.4 身体弯曲频率测定。挑取状态相当的同期化线虫，放置在无大肠杆菌的NGM平板上，记录1 min内线虫身体弯曲的次数，每组测定50条，重复3次。一次身体弯曲是指线虫向身体所在直线的方向做一个波长的运动[12]。

1.4.5 热应激能力测定。取同期化的线虫，于20℃恒温培养48 h后，转移到37℃下培养，每隔1 h记录线虫的存活率，每组测定50条，重复3次。线虫死亡判断标准同寿命测试[13]。

1.5 数据处理

采用SPSS 19.0软件进行数据分析，组间比较采用t检验。

2 结果与分析

2.1 石斛多糖对秀丽隐杆线虫寿命的影响

衰老研究主要关注的指标之一是生物体的寿命长短[14]。铁皮石斛、细茎石斛和鼓槌石斛在石斛属中均属于多糖含量较高的种类，试验分别选取不同浓度的石斛多糖添加涂布于NGM平板，观测NGM平板秀丽隐杆线虫的寿命，结果如表1所示。不同浓度的石斛多糖能显著延长秀丽隐杆线虫的最长寿命和平均寿命；且随着浓度的增大，石斛多糖延长寿命的效果越明显，浓度为80 mg/L的细茎石斛多糖延长寿命的效果最好，与不添加多糖的对照组相比，平均寿命增加了33.3%。

在评估药物抗衰老功能特性时，不仅需要考虑药物对生物体寿命的影响，还需要关注药物在延长寿命的同时对机体正常生理活动是否有影响[15]。由表2可知，添加不同浓度的铁皮石斛多糖、细茎石斛多糖和鼓槌石斛多糖，秀丽隐杆线虫的产卵量与对照组没有明显差异，表明石斛多糖在延长秀丽隐杆线虫寿命的同时并没有降低其生殖能力。

2.2 石斛多糖对秀丽隐杆线虫运动行为能力的影响

运动是生命的基本存在形式，反映了神经系统基本功能完好，生物体衰老往往伴随着运动行为能力的下降[16]。对于线虫，运动行为能力的丧失意味着死亡。由表3、表4可知，与不添加石斛多糖的对照组相比，3种石斛多糖对秀丽隐杆线虫的头部摆动频率和身体弯曲频率均有明显提升，且随着浓度的增大，石斛多糖对秀丽隐杆线虫运动行为能力的影响越明显；在浓度80 mg/L时，3种石斛多糖对秀丽隐杆线虫头部摆动频率的提升效果相当，而鼓槌石斛多糖对秀丽隐杆线虫身体弯曲频率的提升效果最明显。

表3 不同石斛多糖处理下秀丽隐杆线虫的头部摆动频率

表4 不同石斛多糖处理下秀丽隐杆线虫的身体弯曲频率

2.3 石斛多糖对秀丽隐杆线虫热应激能力的影响

细胞应激是由热、冷、缺氧、酸度变化、炎症、X射线或紫外线照射等引起的，其中急性热应激通过抑制拓扑异构酶Ⅰ的活性影响DNA复制，从而引发正常细胞衰老凋亡，缩短生物体的寿命[17]。生物体对外界环境的抵抗能力被称作对环境的应激能力[17]。由图1可知，在37℃条件下，石斛多糖处理的秀丽隐杆线虫存活率较对照得到了明显提高，并且呈现出一定的浓度依赖性。其中，80 mg/L细茎石斛多糖的效果最为明显，且与其延长寿命效果相吻合。表明石斛多糖能够有效提高秀丽隐杆线虫的热应激能力，其效果与延长秀丽隐杆线虫的寿命密切相关。

3 讨论

衰老是生物体随着年龄增长在功能、形态等方面出现不可逆的渐进性退化，是生物体内自发的必然过程[18]。它与老年病的发生密切相关。延缓衰老可减少动脉粥样硬化、冠心病等老年病的发生[19]。一些名贵中药材，例如人参[20]、灵芝[21]、石斛[2]等，都具有一定的延缓衰老作用，但对其效价成分和作用机制尚不清楚，限制了这些药材的开发利用。

铁皮石斛、细茎石斛和鼓槌石斛含有丰富的植物多糖且表现出良好的离体抗氧化活性。本研究结果表明，从这3种石斛中提取得到的粗多糖均能在不影响秀丽隐杆线虫产卵量的前提下延长其平均寿命和最长寿命。

石斛多糖一般由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等单糖组成2～5个多糖亚组分复合而成，用含有石斛多糖的培养基培养秀丽隐杆线虫，线虫的头部摆动频率、身体弯曲频率以及热应激条件下的存活率均随着多糖浓度的升高而明显增加，与延长线虫的寿命有着密切的正相关关系，因而提高线虫的运动行为能力和热应激能力可能是延缓其衰老的重要作用机理。但是，关于生物体衰老目前有自由基学说、DNA损伤修复学说、端粒和端粒酶学说、细胞凋亡学说等多种理论[22-23]，其各自的调控机制也错综复杂，因而石斛多糖延缓衰老的作用机制仍有待继续深入研究。