水飞蓟素通过Slit2 调控非小细胞肺癌细胞增殖及凋亡的实验研究
2022-11-17宋爱英耿智馨
唐 寅 宋爱英 韩 笑 耿智馨
1.黑龙江中医药大学附属第一医院肿瘤科，黑龙江哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院康复科，黑龙江哈尔滨 150040
晚期非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）对化疗不敏感、化疗效果差、5 年存活率低[1-2]，寻找新的NSCLC 治疗药物具有迫切的临床需求。水飞蓟素（silymarin，SM）是植物水飞蓟中提取得到的黄酮类化合物，有研究发现在肝癌中SM 激活Slit2/ROBO1 通路抑制C-X-C 基序趋化因子受体4（C-XC motif chemokine receptor 4，CXCR4）的表达，进而抑制肝癌细胞生长[3]。Tseng 等[4]及刘倩等[5]的研究分别证实，Slit2 的低表达及CXCR4 的高表达与NSCLC 预后不良有关，但能够调控Slit2/ROBO1 通路及CXCR4表达的SM 在NSCLC 增殖及凋亡中的调控作用及机制尚不清楚。因此，本研究将通过细胞实验观察SM 通过Slit2 调控NSCLC 细胞增殖及凋亡的作用机制，旨在为今后发现NSCLC 新的治疗药物提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 NSCLC 细胞株A549（上海中科院细胞资源中心）。
1.1.2 药品与试剂 SM（美国Sigma 公司，货号：S0292）；阴性对照（negative control，NC）siRNA、Slit2 siRNA（上海吉玛公司）；MTS 法细胞增殖检测试剂盒（丹麦Promega 公司，货号：G3582）；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天公司，货号：C1086）；Slit2（货号：47600）、CXCR4（货号：97680）的单克隆一抗（美国CST 公司）；ROBO1 的单克隆一抗（美国Abcam 公司，货号：ab184622）。转染试剂盒（Invitrogen 公司，货号：11668）。
1.1.3 仪器 细胞培养箱（型号：Thermo371，美国Thermo 公司）；显微镜（型号：TE2000-U，日本Nikon 公司）；荧光定量PCR 仪（型号：ABI7500，美国ABI 公司）；电泳仪（上海天能公司，型号：EPS600）；转膜仪及配套电源（型号EPS1000，上海天能公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞分组及干预 为研究SM 对A549 细胞增殖及凋亡的影响，细胞随机分为对照组及不同剂量SM 组，对照组用不含药物的培养基处理，SM 组用含有10、20、40 mg/L SM 的培养基处理；为研究40 mg/L SM 调控A549 细胞增殖及凋亡的作用，细胞随机分为si-NC 组、si-NC+40 mg/L SM 组、si-Slit2+40 mg/L SM组，si-NC 组转染NC siRNA，si-NC+40 mg/L SM 组在含有40 mg/L SM 的培养基中转染NC siRNA，si-Slit2+40 mg/L SM 组在含有40 mg/L SM 的培养基中转染Slit2 siRNA。转染均按照试剂盒说明书Lipofectamine 2 000 转染试剂进行。每组均干预48 h，设置5 个复孔。
1.2.2 MTS 法检测细胞增殖 将A549 细胞及转染后的A549 细胞消化后，按照每孔2×103个细胞接种在96 孔培养板内，分组干预48 h 后每孔加入MTS 试剂盒的检测液20 μl，继续培养4 h 后在酶标仪上检测490 nm 波长的吸光值A490。
1.2.3 TUNEL 法检测细胞凋亡 将A549 细胞及转染后的A549 细胞消化后，按照每孔2×104个细胞接种在24 孔培养板内，分组干预48 h 后固定细胞并采用TUNEL 试剂盒进行TUNEL 染色及DAPI 染色，在显微镜下随机观察3 个高倍视野内TUNEL 阳性染色及DAPI 阳性染色的细胞数，计算细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞数/DAPI 阳性细胞数×100%。
1.2.4 Western blot 检 测Slit2、ROBO1、CXCR4的表达 将A549 细胞及转染后的A549 细胞消化后，按照每孔2×105个细胞接种在12 孔培养板内，分组干预48 h 后采用细胞裂解液提取蛋白，将20 μg 蛋白与缓冲液混合并在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，电转移至硝酸纤维素膜，在5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，在1∶1 000 稀释的Slit2、ROBO1、CXCR4 一抗或1∶5 000稀释的β-actin 一抗中4℃孵育过夜。次日，在1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶二抗中室温孵育1 h，最后在凝胶分析系统中进行成像并对蛋白条带进行半定量分析，得到Slit2、ROBO1、CXCR4 的表达水平。
1.3 统计学方法
采用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析两两比较采用LSD-t 法。P ＜0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同剂量SM 对A549 细胞增殖及凋亡的影响
各组细胞TUNEL 染色见图1B，凋亡细胞TUNEL 染色阳性显绿色荧光，细胞核DAPI 染色显蓝色荧光。10、20、40 mg/L SM 组A549 细胞的A490水平低于对照组、凋亡率高于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；20 mg/L SM 组A549 细胞的A490 水平低于10 mg/L SM 组，凋亡率高于10 mg/L SM 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）；40 mg/L SM 组A549 细胞的A490水平低于对照组10、20 mg/L SM 组，凋亡率高于10、20 mg/L SM组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图1。
图1 不同剂量SM 对A549 细胞增殖及凋亡的影响（n=5）
2.2 不同剂量SM 对A549 细胞中Slit2、ROBO1、CXCR4 表达的影响
与对照组比较，10、20、40 mg/L SM 组A549 细胞中Slit2、ROBO1 的表达水平升高，CXCR4 的表达水平降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与10 mg/L SM 组比较，20 mg/L SM 组A549 细胞中CXCR4 的表达水平降低，差异有统计学意义（P ＜0.05），40 mg/L SM 组A549 细胞中Slit2、ROBO1 的表达水平升高，CXCR4 的表达水平降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与20 mg/L SM 组比较，40 mg/L SM 组A549 细胞中Slit2、ROBO1 的表达水平升高，CXCR4 的表达水平降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2。
图2 不同剂量SM 对A549 细胞中Slit2、ROBO1、CXCR4 表达的影响（n=5）
2.3 敲低Slit2 对SM 调控A549 细胞增殖及凋亡的影响
与si-NC 组比较，si-NC+40 mg/L SM 组A549 细胞中Slit2 的表达水平及凋亡率升高，A490水平降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与si-NC+40 mg/L SM组比较，si-Slit2+40 mg/L SM 组A549 细胞中Slit2 的表达水平及凋亡率降低，A490水平增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3。
图3 敲低Slit2 对SM 调控A549 细胞增殖及凋亡的影响（n=5）
2.4 敲低Slit2 对SM 调控A549 细胞中ROBO1、CXCR4 表达的影响
与si-NC 组比较，si-NC+40 mg/L SM 组A549 细胞中ROBO1 的表达水平增加，CXCR4 的表达水平降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与si-NC+40 mg/L SM 组比较，si-Slit2+40 mg/L SM 组A549 细胞中ROBO1 的表达水平降低，CXCR4 的表达水平增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图4。
图4 敲低Slit2 对SM 调控A549 细胞中ROBO1、CXCR4 表达的影响（n=5）
3 讨论
中药具有抗肿瘤作用，不同的中药材及其活性成分既能直接发挥抗癌作用，也能起到放化疗增敏作用[6-7]，另有部分中药能够减轻放化疗的毒副作用[8-9]。中药材水飞蓟中的活性成分SM 在临床上用于治疗肝脏疾病，能够减轻肝损伤、延缓肝纤维化[10-11]，也有多项基础研究证实SM 具有抗癌作用[3,12-16]。本研究的分析结果显示：SM 显著降低NSCLC 细胞增殖A490水平、增加细胞凋亡率，提示SM 能够在NSCLC 细胞中发挥抑癌作用，同时也增加Slit1 及ROBO1 的表达、降低CXCR4 的表达。
Slit2/ROBO1 通路是已知具有抑癌作用的信号通路，NSCLC 组织中低表达的Slit2、ROBO1 及高表达的CXCR4 与NSCLC 预后不良及远处转移有关[4-5,17-19]。该通路的抑癌作用与抑制下游CXCR4 的表达有关[20-22]。在NSCLC 中，已有研究通过沉默CXCR4 表达的方式证实CXCR4 对NSCLC 细胞的增殖具有促进作用、凋亡具有抑制作用[23-25]。本研究在敲低Slit2 后观察到SM 在NSCLC 细胞中抑制细胞增殖及CXCR4 表达、促进细胞凋亡及ROBO1 表达的作用明显减弱，提示SM 对NSCLC细胞的调控作用部分由Slit2/ROBO1 通路介导。
综上所述，本研究通过细胞实验初步发现SM 对NSCLC 细胞的增殖具有抑制作用、凋亡具有促进作用；SM 的抑癌作用与激活Slit2/ROBO1 通路、抑制下游CXCR4 的表达有关。
