IGF1 基因慢病毒转染骨髓间充质干细胞治疗骨性关节炎的实验研究

向文远 邓迎杰 廖 军 方 锐

1.新疆医科大学第四临床医学院，新疆乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学附属中医医院骨科，新疆乌鲁木齐 830000

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是老年人致残的主要原因[1-2]。因此寻找OA 的有效治疗手段是骨科学领域研究的重点内容。以往已有研究[3-4]证实髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyml stem cells，BMSCs）能通过多途径对骨组织损伤起到修复作用[5]，但是其成骨能力较弱，而IGF1 基因是一种能诱导BMSCs 向成软骨细胞和成骨细胞分化、成熟的关键转录因子，在骨修复与重建中发挥重要作用[6]。本研究将通过构建IGF1 基因慢病毒载体，并将其转染BMSCs 后对大鼠OA 模型进行治疗，以期为OA 的临床治疗奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级Wistar 大鼠40 只，10～12 周龄，体重280～320 g，雄性，购自新疆医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（新）2018-0002，使用许可证号：SYXK（新）2018-0003，饲养条件：恒温20～25℃、恒湿（50±5）%。实验经新疆医科大学附属中医医院伦理委员会批准（2019102283）。

1.2 主要试剂及仪器

Lenti-IGF 1-EGFP 慢病毒（上海吉凯基因化学技术有限公司，批号：H40582）；Ⅰ型胶原C 端肽（C-terminal peptide of type Ⅰcollagen，CTX-Ⅰ）试剂盒（elabscience，批号：E-EL-R1456c）；CTX-Ⅱ试剂盒（elab science，批号：E-EL-R2554c）；白介素（interleukin，IL）-1α 试剂盒（elabscience，批号：E-EL-R0011c）；IL-6 试剂盒（elabscience，批号：E-EL-R0015c）；Trizol（Aidlab，批 号：Lot：252250AX）；HiScript Reverse Transcriptase（RNase H）（VAZYME，批号：R101-01/02）；SYBR Green Master Mix（RNase H）（VAZYME，批号：Q111-02）；SYBR Green Master Mix（RNase H）（VAZYME，批号：ET105-01）；兔多抗GAPDH（杭州贤至生物有限公司，批号：AB-P-R 001）；鼠单抗糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）（Abcam，批号：ab93926）；兔单抗β-catenin（Abcam，批 号：ab32572）；兔多抗Wnt1（Abcam，批号：ab85060）。高速离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司，型号：LB-516）；电热恒温培养箱（上海培因实验仪器有限公司，型号：TM-442）；全自动多功能酶标仪（上海百千生物科技有限公司，型号：MSL602）；实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪（ABI，型号：QuantStudio 6）；水平电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司，型号：JY300）；酶标仪（Thermo，型号：mμlISKANMK3）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司，型号：DHG 9203A）。

1.3 BMSCs 的分离

10 只Wistar 大鼠处死，取出双侧股骨，用10 ml注射器吸出干骺端红骨髓，加入含20 μg/ml 肝素的IMDM 培养液中。充分重悬后置入离心管，1 500 r/min条件下离心10 min（离心半径10 cm），将脂肪及上清液弃去。加DMEM 培养液混匀稀释至10 ml，重悬后过90 目滤网，接种。获得8×105/ml 密度的细胞悬液，于5%CO2与37℃培养箱中进行培养。

1.4 BMSCs 的培养及鉴定

将第3 代BMSCs（1×105个/cm2）接种于盖玻片上，待贴壁细胞密度70%时取出盖玻片。一抗兔抗鼠CD44 单克隆抗体（1∶25）4℃湿盒孵育过夜，使用PBS进行3 次漂洗。二抗山羊抗兔IgG（1∶50）室温避光孵育2 h，使用PBS 进行3 次漂洗。避光条件下加DAB显色剂20 min，苏木精染色10 min，水洗，95%甘油封片，倒置显微镜下观察实验结果并拍照记录。第三代的BMSCs（1×106个）4 份分别与FITC 标记的CD29、CD34、CD45、CD105，37℃孵育30 min，使用PBS 进行2 次漂洗，上机检测。

1.5 IGF1 基因慢病毒转染BMSCs

取第3 代BMSCs 接种于6 孔板，待细胞密度长至60%时，用感染复数为50 的Lenti-IGF 1-EGFP 慢病毒转染细胞，转染48 h 后，在荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白的表达情况，先在白光视野下计数细胞总数，再在荧光视野下计数表达荧光的细胞数目，转染效率=（荧光表达细胞数目/白光视野细胞总数）×100%，取10 个视野，计算平均值。取转染后的BMSCs接种于6 孔板，加入不同质量浓度（0、1、2、3、4、5 mg/ml）嘌呤霉素，选择在10～14 d 内让全部细胞死亡的最低浓度作为最佳筛选浓度。另取转染后的BMSCs 接种于6 孔板，孵育24 h 后加入最佳筛选浓度的嘌呤霉素，每隔2 d 更换新的含最佳筛选浓度嘌呤霉素的培养液，连续培养10 d。收集抗性细胞，获得稳定转染细胞株。

1.6 OA 大鼠模型制备及分组

取30 只Wistar 大鼠，采用膝关节前交叉韧带切断法建立OA 模型：麻醉后，剃净手术区域，从内侧切开膝关节腔，外翻膑骨，将前交叉韧带进行剪断。造模成功标准：对关节软骨组织进行病理学检查，软骨表面粗糙变薄，部分细胞核固缩、坏死，细胞排列紊乱表示造模成功[7]。建模成功2 周后按照随机数字表法分为BMSCs+IGF1 组、BMSCs 组、模型组，每组10 只。BMSCs+IGF1 组大鼠膝关节腔内注射0.1 ml IGF1 基因慢病毒转染BMSCs（1×107个），BMSCs 组大鼠膝关节腔内注射0.1 ml BMSCs（1×107个）；模型组大鼠膝关节腔内注射0.1 ml 生理盐水。

1.7 HE 染色观察大鼠膝关节软骨组织病理学变化

分离膝关节软骨组织，经10%多聚甲醛固定，将固定的软骨组织，经脱钙、水合、透明、石蜡包埋后切片，切片厚度5 μm，采用HE 染色，梯度酒精脱水，中性树胶封固，镜检观察膝关节软骨组织病理学变化。

1.8 ELISA 检测大鼠血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ、IL-1α、IL-6 水平

取三组大鼠血液2 ml，2 000 r/min 条件下离心10 min（离心半径10 cm）获取血清。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液100 μl，余孔分别加标准品或待测样品100 μl。给酶标板覆膜，37℃孵育90 min。弃去孔内液体，甩干，不用洗板，每孔中加入生物素化抗体工作液100 μl，给酶标板加上覆膜，37℃温育1 h。弃去液体，洗板3 次，每次浸泡30 s，大约350 μl/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。每孔加酶结合物工作液100 μl，加上覆膜，37℃温育30 min。弃去孔内液体，甩干，洗板5 次。每孔加显色剂90 μl，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15 min。每孔加终止液50 μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。立即用酶标仪在450 nm 波长测量各孔光密度。

1.9 实时荧光定量PCR 大鼠膝关节软骨组织中骨钙素（osteocalcin，OC）、GSK-3β、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Runt 相关转录因子2（Runt-associated transcription factor 2，Runx2）的mRNA 表达水平

取三组大鼠膝关节软骨组织100 mg，加入1 ml Trizol 试剂，用匀浆器研磨成浆，移至无RNase 的1.5 ml EP 管中，裂解10 min。加入200 μl 氯仿，剧烈颠倒混匀数次，室温放置5 min。4℃，12 000 r/min，离心15 min（离心半径10 cm），可见分成上（RNA）中（蛋白）下（DNA）三相。转移上层水相（约400 μl）于另一新1.5 ml EP 管中，加入400 μl 异丙醇，混匀后室温静置10 min。4℃，12 000 r/min，离心10 min（离心半径10 cm），管底可见白色的RNA 沉淀。取RNA 进行逆转录成cDNA，反应条件：25℃5 min，50℃15 min，85℃5 min，4℃10 min；cDNA 做N 倍稀释，反应条件：50°C 2 min，95°C 10 min；95°C 30 s，60°C 30 s，循环40 次，以GAPDH 为内参，绘制溶解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.10 Western blot 检测测大鼠膝关节软骨组织中βcatenin、Wnt1、GSK-3β 的蛋白表达水平

取三组大鼠膝关节软骨组织100 mg，置于2 ml EP 管中，每管加200 μl 单去污剂裂解液裂解（含2 μl PMSF、2 μl 磷酸酶抑制剂），置于自动匀浆机中匀浆，匀浆完成后将EP 管置于冰上30 min 充分裂解。裂解30 min 后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml 离心管中，然后在4℃下12 000 r/min 离心5 min（离心半径10 cm），取上清为总蛋白，二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。等量总蛋白上样，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转至聚偏氟乙烯膜。TBST 漂洗，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入兔抗鼠一抗工作液(1∶100 0)，4℃孵育过夜。TBST 漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗工作液(1∶100 0)，37℃孵育1 h。TBST漂洗，暗室内二氨基联苯胺显色、曝光。Bio-Rad 分析系统扫描分析，目的蛋白表达量=目的蛋白吸光度值/GAPDH 吸光度值。

1.11 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对所得数据进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t检验；计数资料采用例数表示，比较采用χ2检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs 的鉴定

细胞形态观察显示细胞排列紧密，逐渐融合成片，且细胞形态均一，呈梭形生长，生长旺盛。流式细胞仪检测结果显示，培养后的BMSCs 均表达CD29、CD34、CD45、CD105。见图1。

图1 BMSCs 的鉴定

2.2 IGF1 基因慢病毒转染BMSCs 的效果

转染48 h 后，IGF1 基因慢病毒对BMSCs 的转染效率为（90.36±2.18）%，并经最佳浓度（10 mg/ml）的嘌呤霉素筛选得到了稳定转染细胞株。见图2。

图2 IGF1 基因慢病毒转染BMSCs 的效果（200×，标尺长100 μm）

2.3 三组大鼠膝关节软骨组织病理学情况

模型组关节软骨面不平整，表层变薄，部分细胞核固缩、坏死，细胞排列紊乱。BMSCs 组小鼠膝关软骨退变程度较模型组轻微，尚未发现缺损迹象，关节面较平整。BMSCs+IGF1 组软骨完整，未见明显退化，关节面平整。见图3。

图3 三组大鼠膝关节软骨组织病理学情况

2.4 三组大鼠血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ、IL-1α、IL-6 水平比较

BMSCs 组血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ、IL-1α、IL-6 水平均明显低于模型组（P ＜0.05），BMSCs+IGF1 组明显低于BMSCs 组（P ＜0.05）。见表2。

表2 三组大鼠血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ、IL-1α、IL-6 水平的比较（）

表2 三组大鼠血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ、IL-1α、IL-6 水平的比较（）

注 与模型组比较，aP ＜0.05；与BMSCs 组比较，bP ＜0.05。BMSCs：骨髓间充质干细胞；CTX-Ⅰ：Ⅰ型胶原C 端肽；IL：白介素

2.5 三组OC、GSK-3β、ALP、Runx2mRNA 表达水平比较

BMSCs 组OC、GSK-3β、ALP、Runx2 mRNA 表达水平均明显低于模型组（P ＜0.05），BMSCs+IGF1 组明显低于BMSCs 组（P ＜0.05）。见表3。

表3 三组大鼠OC、GSK-3β、ALP、Runx2 mRNA表达水平的比较（）

表3 三组大鼠OC、GSK-3β、ALP、Runx2 mRNA表达水平的比较（）

注 与模型组比较，aP ＜0.05；与BMSCs 组比较，bP ＜0.05。BMSCs：骨髓间充质干细胞；OC：骨钙素；GSK-3β：糖原合成酶激酶-3β；ALP：碱性磷酸酶；Runx2：Runt 相关转录因子2

2.6 三组β-catenin、Wnt1、GSK-3β 蛋白表达水平的比较

BMSCs 组β-catenin、Wnt1、GSK-3β 蛋白表达水平均明显低于模型组（P ＜0.05），BMSCs+IGF1 组明显低于BMSCs 组（P ＜0.05）。见表4、图5。

表4 三组大鼠β-catenin、Wnt1、GSK-3β 蛋白表达水平的比较（）

表4 三组大鼠β-catenin、Wnt1、GSK-3β 蛋白表达水平的比较（）

注 与模型组比较，aP ＜0.05；与BMSCs 组比较，bP ＜0.05。BMSCs：骨髓间充质干细胞；GSK-3β：糖原合成酶激酶-3β

图5 三组β-catenin、Wnt1、GSK-3β 蛋白的条带图

3 讨论

近年来，BMSCs 成为骨组织工程学领域一个热点研究内容，给OA 的治疗带来了更大的希望。BMSCs成骨能力较弱，必须进行体外诱导后才能应用于组织工程的修复[8]。有研究[9]显示，慢病毒携带骨形态发生蛋白2 和转化生长因子β2 的重组质粒过表达具有协同促进大鼠BMSCs 成骨分化的作用。

IGF1 是一个由人类基因IGF1 编码的蛋白质。以往有研究[10]显示，IGF1 促进软骨损伤愈合的机制为：①对软骨细胞的分裂与增殖进行刺激；②增加细胞外基质的含量；③对软骨细胞表型稳定进行维持；④对软骨细胞的凋亡进行抑制。IGF1 能够有效促进BMSCs的增殖及软骨分化，并维持软骨胶原纤维的稳定性[11]。因此本研究选择了IGF1 基因慢病毒载体，通过慢病毒感染体外培养的BMSCs 将外源性IGF1 基因整合至细胞，IGF1 基因慢病毒对BMSCs 的转染效率为（90.36±2.18）%，并筛选得到了稳定转染细胞株。提示外源IGF1 基因已成功整合至BMSCs，并能够稳定表达IGF1 基因。为探讨IGF1 基因慢病毒转染BMSCs对OA 关节损伤的修复能力，实验构建了OA 大鼠模型，通过向膝关节腔内注射IGF1 基因慢病毒转染骨BMSCs，观察其在关节损伤修复中的作用。结果显示：BMSCs+IGF1 组大鼠膝关节软骨完整，无明显退化，关节面平整，BMSCs 组与模型组大鼠均存在不同程度软骨退变，关节面不平，提示IGF1 基因慢病毒转染BMSCs 能有效改善OA 大鼠的病理损伤。BMSCs 组的血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ、IL-1α、IL-6 水平，OC、GSK-3β、ALP、Runx2 mRNA 表达水平，β-catenin、Wnt1、GSK-3β蛋白表达水平均明显低于模型组，BMSCs+IGF1 组明显低于BMSCs 组，与段志斌[12]等研究结论基本一致。CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ是骨吸收生化标志物，膝关节OA 患者血清CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ呈过表达[13-14]。IL-1α、IL-6是炎症指标，OA 患者炎症越严重，血清IL-1α、IL-6水平越高[15-17]。此外，OC、GSK-3β、ALP、Runx2、βcatenin、Wnt1 等分子系统或信号通路对于调节破骨细胞功能起到至关重要的作用，OA 发生发展过程中伴随着以上分子系统或信号通路上调[18]。由此可以说明，BMSCs 可通过降低相关骨吸收指标、炎症因子水平及调控β-catenin/Wnt1/Runx2 信号通路，对OA 大鼠起到治疗作用，而IGF1 基因慢病毒转染BMSCs 的治疗作用更显著。

综上所述，IGF1 基因慢病毒转染BMSCs 能有效改善OA 大鼠的病理损伤，能明显促进膝关节损伤修复，可为OA 的临床治疗奠定基础。