piR-128 通过DNA 甲基化酶3B 对结直肠癌的调节作用及诊断价值

高晓斌 武雪亮 赵轶峰 聂双发 梁 峰 张迎春

河北北方学院附属第一医院普通外科，河北张家口 075000

结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，具有高度侵袭性，治疗选择有限且5 年生存率较低，因此迫切需要寻找有效的分子生物标志物，这些生物标志物可以促进早期检测或肿瘤对特定疗法的反应，以降低死亡率。Piwi 相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）是一种新型的RNA 干扰家族，已被证明是癌症早期检测和治疗的有效生物标志物[1-4]。与微RNA 和小干扰RNA 不同，piRNA 的特征是具有21～35 个核苷酸的单链小非编码RNA 沉默子，带有2’-O-甲基修饰的3’末端并与Piwi 蛋白结合形成功能性沉默复合物[5-6]。piRNA 的失调发生在多种癌症中，例如多发性骨髓瘤、乳腺癌、食管癌[7]。基于piRNA 在癌症样本中的表达差异可以将癌症患者与健康人群区分开，其检测灵敏度高于癌胚抗原和糖类抗原19-9[8-9]。此外，手术前后患者piRNA 的表达变化可用于术后长期监测和疾病进展指标[10]。而本研究则旨在探究piR-128 在结直肠癌中发挥的生物学作用及其对DNA 甲基化酶（DNA methylase，DNMT）3B 的调控作用。

1 材料与方法

1.1 患者和标本的获取

选取2018 年2 月至2020 年1 月于河北北方学院附属第一医院（以下简称“我院”）普通外科诊断为结直肠癌的54 例患者的手术标本，包括其结直肠癌组织和匹配的正常组织（距肿瘤边缘3～7 cm），且经我院病理科病理诊断。参照美国癌症联合委员会对研究对象进行TNM 分期[7]，根据《中国结直肠癌诊疗规范》[10]评估其组织学等级。纳入标准：①在我院普通外科行手术治疗；②年龄≥18 岁；③首次诊断。排除标准：①合并其他系统肿瘤；②采用化学疗法或放射疗法；③孕妇。本研究获得我院伦理审查委员会批准（伦审：K20150212）。

1.2 RNA 提取、逆转录和qRT-PCR

使用Trizol（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国）从人类组织或细胞中提取总RNA，通过Nanodrop 2 000（Invitrogen，美国）定量总RNA，使用miScript 逆转录（RT）试剂盒（Qiagen GmbH，美国）生成cDNA，使用miScript SYBR Green PCR Kit（Qiagen，美国）进行qRT-PCR，U6 用作内部对照，PCR 反应在ABI7500 FAST 实时PCR 系统（Applied Biosystems，美国）上进行，反应条件：变性95℃，30 s；退火58℃，1.0 min；延伸72℃，1.5 min；35 个循环。通过比较交叉阈值（Ct）方法计算相对表达，并使用Graph Pad Prism v.5 进行数据分析，引物序列见表1。观察癌组织和邻近正常组织中piR-128、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B 水平的差异，分析其与DNMT3B 的相关性，再进一步分析不同piR-128、DNMT3B 水平患者与其临床特征的关系。

表1 引物序列

1.3 体外实验

1.3.1 细胞培养和转染 人结直肠癌细胞LIM1215 购自美国典型收藏物保藏中心的细胞库，在补充10%FBS（Invitrogen，美国）的RPMI1640 培养基（赛多利斯生物试剂，德国）中培养，按照试剂盒说明书Lipofectamine 2 000 转染试剂进行空白（对照组）、piR-128 抑制剂（piR-128 抑制剂组）、si-DNMT3B（si-DNMT3B组）、piR-128 抑制剂+DNMT3B Vector（抑制剂+Vector组）的转染，转染后48 h 收获细胞用于后续实验，所用材料均购自浙江格鲁斯特生物技术公司。

1.3.2 Western blot 将细胞与300 μl RIPA 裂解液（博拓生物科技股份有限公司，中国）和苯甲磺酰氟（PMSF，博拓生物科技股份有限公司，中国）在冰上放置30 min 以裂解细胞，获取上清液后使用BCA 蛋白质浓度测定试剂盒（博拓生物科技股份有限公司，中国）测量蛋白质裂解物浓度，通过SDS-PAGE 分离总共40 μg 的蛋白裂解物，然后转移到PVDF 膜上，用5%封闭缓冲液封闭膜2 h 后，将膜与抗DNMT3B 和GAPDH 的一抗（1∶500）在4°C 下免疫印迹过夜，然后用HRP 偶联的二抗（1∶200）室温孵育2 h，最后，使用ECL Super Signal West Pico 套件进行信号检测。

1.3.3 增殖测定 将细胞以3 000 个细胞/孔的密度接种在96 孔板中，各组转染24 h 后将10 μl CCK8试剂添加到37℃的普通培养基中反应2 h，然后分别在0、12、24、36、48、72 h 时通过酶标仪（Rayto，中国）记录450 nm 处的吸光度，各做5 次重复实验。

1.3.4 transwell 实验 在37℃下将40 μl 的Matrigel（1 μg/μl，BD Biosciences，美国）添加到transwell 上室预先包被2 h，各组转染24 h 后将100 μl 细胞悬液接种到上腔室中，并将600 μl 完全培养基添加到下腔室中，孵育24 h 后，将下部小室中的细胞用4%多聚甲醛固定15 min，然后用5%结晶紫染色，用棉签涂抹器除去上腔室中未迁移的细胞，拍摄代表性图像，并对5 个随机视野中的细胞进行计数计数，观察细胞侵袭个数，各做5 次重复实验。

1.3.5 划痕实验 将细胞以2×105个细胞/孔的密度接种在6 孔板中，各组转染24 h 后使用200 μl 无菌移液器进行划痕，各做5 次重复实验，用磷酸盐平衡盐溶液洗涤后，将细胞在补充有1% FBS 的RPMI 1640 培养基中培养24 h，在Leica 显微镜对伤口愈合进行成像，观察细胞迁移率（迁移宽度/总宽度）×100%。

1.3.6 流式细胞仪 各组转染24 h 后收集细胞并以1×105个细胞/ml 的密度重悬于结合缓冲液中，用5 μl Annexin V-APC 和5 μl 7-AAD 进行双重染色后，按照生产商的说明使用Cyto FLEX 流式细胞仪（Beckman Coulter，美国）对细胞进行分析以检测细胞凋亡，各做5 次重复实验。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 对所得数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验；不符合正态分布的计量资料采用散点图表示，比较采用非参数检验。计数资料采用例数表示，比较采用χ2检验。采用Spearman 相关系数分析相关性，受试者操作特征曲线分析诊断价值。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织与邻近正常组织中piR-128 和DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA 表达比较及piR-128 与DNMT3B 的相关性分析

结直肠癌组织中piR-128、DNMT3B mRNA 的表达水平高于邻近正常组织，差异有统计学意义（P ＜0.05）。相关性分析结果显示，结直肠癌组织中piR-128 与DNMT3B mRNA 表达水平呈正相关（rs=0.574，P ＜0.001）。见图1。

图1 结直肠癌组织与邻近正常组织中piR-128、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B 表达比较及piR-128 与DNMT3R 的相关性分析

2.2 不同piR-128、DNMT3B 水平患者与其临床特征的关系

以piR-128 相对表达水平的中位数将患者分为piR-128 高表达患者（＞2，39 例）和piR-128 低表达患者（≤2，15 例），结果显示piR-128 表达水平与临床特征无关（P >0.05）。见表2。以DNMT3B mRNA 相对表达水平将患者分为DNMT3B 高表达患者（≥1，35 例）和DNMT3B 低表达患者（<1，19 例），相关性分析结果显示DNMT3B 表达水平与患者临床病理特征之间无关（P >0.05）。见表3。

表2 不同piR-128 水平患者与其临床特征的关系（例）

表3 不同DNMT3B 水平患者与其临床特征的关系（例）

2.3 piR-128 对结直肠癌的诊断价值分析

piR-128 诊断结直肠癌的截断值为3.52，曲线下面积为0.713（95%CI：0.615～0.810，P ＜0.001），约登指数为0.398，灵敏度为62.9%，特异度为76.9%。见图2。

图2 piR-128 诊断结直肠癌的受试者操作特征曲线

2.4 四组细胞piR-128、DNMT3B 表达水平及细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡情况比较

piR-128 抑制剂组、抑制剂+Vector 组piR-128、DNMT3BmRNA 水平低于对照组，si-DNMT3B 组DNMT3BmRNA 水平低于对照组，抑制剂+Vector 组DNMT3BmRNA 水平高于si-DNMT3B 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3A。piR-128 抑制剂组、si-DNMT3B 组、抑制剂+Vector 组、DNMT3B 蛋白水平低于对照组，抑制剂+Vector 组DNMT3B 蛋白水平高于si-DNMT3B 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3B。si-DNMT3B 组、piR-128 抑制剂组、抑制剂+Vector 组在24、36、48、72 h 的吸光度均低于对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3C。piR-128 抑制剂组、si-DNMT3B 组、抑制剂+Vector 组细胞侵袭能力均低于对照组，抑制剂+Vector 组高于piR-128 组、si-DNMT3B 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3D。piR-128 抑制剂组、si-DNMT3B 组、抑制剂+Vector 组细胞迁移率均低于对照组，抑制剂+Vector 组高于piR-128 抑制剂组、si-DNMT3B 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3E。piR-128 抑制剂组、si-DNMT3B 组、抑制剂+Vector 组细胞凋亡率均高于对照组，抑制剂+Vector 组低于si-DNMT3B 组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3F。

图3 四组细胞piR-128、DNTM3B 表达水平及细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡情况比较（n=5）

3 讨论

先前研究表明，piRNA 是一种重要的生物标志物，在多种人类癌症中失调[11-13]。piR-128 在包括乳腺癌、食管癌、肝癌、前列腺癌和多发性骨髓瘤在内的癌症中上调[14-19]，在胃癌和肾癌中表达则下调[20-21]。本研究结果显示，piR-128 在结直肠癌组织中表达水平显著升高，并可通过DNMT3B 发挥促癌作用。

在转录后水平上，piRNA 可诱导mRNA 降解及蛋白质磷酸化或泛素化调控癌症的发生和进展[22-24]，机制分析表明，piR-128 通过与其共同转录因子HSF1结合并诱导其在Ser326 位点磷酸化，同时促进HSP27、HSP60、HSP70 的表达，从而促进结直肠癌的增殖而抑制凋亡。本研究在结直肠癌中观察到piR-128 和DNMT3B 的过表达，以及piR-128 和DNMT3B 呈正相关，据此假设piR-128 可能通过DNMT3B 激活异常DNA 甲基化，本研究的细胞实验部分提示，该假设可能为piR-128 的促癌机制。piRNA 在细胞恶性表型（细胞增殖、逃避细胞凋亡、转移、侵袭和细胞周期停滞）中具有调节作用，例如肺癌细胞中piRNA-128 敲低可抑制血管内皮生长因子的分泌，从而引发促血管生成活性[16-18]。此外，piRNA-128 抑制剂可抑制肺癌细胞外囊泡对内皮细胞的促增殖和抗凋亡作用，伴随着上调凋亡相关蛋白和活性氧的产生及下调一氧化氮的产生[21]。而抑制piR-128 可导致结直肠癌细胞系增殖抑制、细胞周期停滞在G1期和细胞凋亡诱导[20]。而本研究中，一系列的体外实验结果显示，piRNA-128 可以在结直肠癌细胞中发挥促癌作用，在使用piRNA-128 抑制剂转染后，DNMT3B 过表达可以逆转piRNA-128 抑制诱导的癌细胞增殖，癌细胞转移能力抑制和细胞凋亡增加，提示piRNA-128 的促癌作用需要通过DNMT3B 来发挥。

综上，本研究提示，piR-128 和DNMT3B 在结直肠癌中上调，较高水平的piR-128 与DNMT3B 表达呈正相关，体外实验则提示piR-128 可以通过上调DNMT3B表达发挥促癌作用，piR-128 在结直肠癌中的诊断和预后生物标志物潜力。