水产品中孔雀石绿污染及检测技术研究进展

樊晓博，高红芳

（1.渭南职业技术学院，陕西渭南 714000；2.渭南市农产品食品检验检测研究中心，陕西渭南 714000）

孔雀石绿（Malachite Green，MG）是一种三苯甲烷类有机物，在皮革、纺织、制陶等领域可作为工业染料[1-2]。在水产养殖中，曾用于预防和治疗水产动物的水霉病、鳃霉病和寄生虫病，在运输和存放中也作为灭菌剂大量使用[3-4]。孔雀石绿进入水产动物体内会大量聚集，通过代谢可转化为隐性孔雀石绿，两种物质通过食物链进入人体，存在致癌、致畸、致突变的严重危害[5-7]。农业部于2002年将其列入《食品动物禁用的兽药及其他化合物清单》，严格规定其为水产养殖运输禁用药物[8]。但由于其价格低廉，疾病防治效果好，违法使用的情况仍长期存在[9-10]。由于工业废水、废渣的违法排放，水体污染和土壤污染也会造成野生水产动物中孔雀石绿残留超标[11]。2019年7月，广东东莞石龙镇渔政大队查获孔雀石绿污染鱼200 kg；2020年7月，香港食品环境卫生署食物安全中心在皖鱼样本中检测出微量孔雀石绿。因此，水产品中孔雀石绿的监管工作仍需加强。本文围绕孔雀石绿的污染情况及残留检测技术展开综述。

1 各地区水产品中孔雀石绿污染情况

由于孔雀石绿可有效治疗和预防水产动物相关疾病，在养殖和运输过程中违禁使用孔雀石绿的情况仍层出不穷。针对淡水鱼类孔雀石绿污染情况的调查研究，可以为相关部门的整治工作提供数据支持，提升水产品的安全指数。

综合近几年不同地区的调查结果发现，珠三角地区市售淡水鱼中孔雀石绿污染情况比较严重，深圳市持续3年监测发现，鱼类污染率达8.82%，特别是深圳市罗湖区，抽取173份淡水鱼样品检测，检出率高达41.62%[12-13]。由于珠三角地区天气炎热潮湿，居民鱼类消费量大，鱼类养殖密度高，更易滋生鱼类水霉病菌，因此在养殖过程中违法使用孔雀石绿的情况对比其他地区更加严重，且在运输过程中为了保持鱼类的存活率也可能存在违规使用的情况。其中污染最严重的鱼类是桂花鱼，平均污染率为20%，罗湖区更高达70%以上[12]。除此之外，罗湖区黄骨鱼、脆肉鱼和生鱼中孔雀石绿检出率也比较高，均在40%以上[13]。不同鱼类存在生理差异，检出率高的鱼类疾病易感性强。此外，气温低的冬春季节鱼类发病率更高，因此采样时间也会影响调查结果。长三角地区孔雀石绿残留率较低，上海市市售的大菱鲆、乌鳢和鳜鱼中孔雀石绿检出率为1.3%，远低于同期开展调查的武汉市（8.93%）和陕西省（7.32%）[14-16]，由于上海市多次开展“三鱼两药”专项整治工作，违禁药物的使用得到了很好的控制。

通过对不同地区淡水鱼进行检测发现，不同省市主要污染的鱼类有很大的差异，这与各个地区饮食偏好相关性高，水产品消费量高的地区比消费量低的地区污染严重，例如宁夏的肉类消费主要是牛羊肉，水产品消费相对较低。祁萍等[17]2010—2017年对1 400份成鱼样品进行检测，结果表明孔雀石绿的残存率仅有0.21%。各个地区淡水鱼中均能检出孔雀石绿残留，总体污染情况比较严重，但根据居民的平均食用量进行膳食暴露评估，居民淡水鱼孔雀石绿暴露健康风险较低。由于孔雀石绿存在致癌危害，相关部门还需要加强监管，借鉴上海市整治工作成效，对市场流通量大的鱼类、易感率高的鱼类进行重点监测，同时加强对养殖和销售人员的宣传教育，从源头杜绝污染水产品的流通。

2 孔雀石绿的检测技术

2.1 仪器分析法

孔雀石绿及其代谢物的检测主要以光谱、色谱和质谱为代表的仪器方法为主[18-19]。其中，常用的有高效液相法[20]、气相质谱法[21]、高效液相-串联质谱法[22-24]等。仪器法均需要对样品进行复杂的前处理，色谱分离后进行检测，一般耗时较长，操作烦琐。为了改善仪器法耗时较长的缺点，各种研究不断优化前处理方法，缩短了检测时间[25]。样品前处理中通常以乙腈[26]作为提取溶剂，可以利用乙腈的极性沉淀组织样品中的蛋白质，提取效果好。提取 液 可 以 通 过QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）方法除杂。陈永平等[27]利用乙二胺-N-丙基硅烷吸附净化提取液，在液相和质谱条件下可以同时测定水产品中2种孔雀石绿和3种酰胺醇类抗生素残留。此外，也可以通过固相萃取的方法除杂，如中性氧化铝固相萃取小柱[28]、分散固相萃取净化管[29]和丙磺酸固相萃取柱[30]等，均可以极大地简化前处理过程，缩短了检测时间，降低了有机溶剂的用量。样品经色谱柱分离后，进入质谱条件检测，以同位素内标法定量，可建立超高效液相色谱-串联质谱法检测水产品中孔雀石绿残留。林侃等[28]以氘代内标物标记，利用此法检测水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿的检出限为0.02 μg/kg，灵敏度高于国标方法。

近年来，一种新型的敞开式电离质谱在食品成分检测中被广泛应用，这种技术是一种常压敞开式离子化技术，无需前处理或仅需简单的预处理，可以直接实现固体表面待测物的离子化，在短时间内完成待测样品中目标分析物的质谱检测[31]。对于直接的离子源而言，样品在电场中可以被直接电离。养殖水中的孔雀石绿可以通过纸喷雾质谱技术筛查，纸喷雾电离技术将待测物加载于固相载体上，可以避免发生毛细管阻塞等问题，检测更加快捷。曾栋等[32]将样品制备液加载于纸基上，在高压电场中目标物以电喷雾的形式进入质谱测定，可在1 min内检测单个样品。直接解吸电离离子源是一种采用介质阻挡放电的敞开式电离质谱技术，以氦气作为离子化气体，实现分析物的表面解吸电离。苏晶等[33]优化质谱条件检测样品中的孔雀石绿及隐性孔雀石绿，不需要色谱分离过程，可在10～15 min内完成检测。

2.2 表面增强拉曼光谱

拉曼光谱技术（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）是一种高效分子振动光谱，在胶体金、银、铜等金属颗粒粗糙表面会发生拉曼强度极大增强的现象，这种效应称为表面增强拉曼散射[34]。利用表面增强拉曼光谱可识别分子特征结构信息，无需复杂前处理，实现无损检测[35-38]。这种检测技术的基底部分在检测中起到了至关重要的作用，可以提升检测的准确性和稳定性，因此基底的研究是该技术的重点。

目前检测中常用的是金属膜基底，这种基底制备对仪器、试剂和人员的要求较低[39]。吴焕乐等[40]在聚二甲基硅氧烷薄片表面采用葡萄糖还原硝酸银沉积银纳米离子制备SERS基片，对鲫鱼中孔雀石绿及其代谢物进行检测。金纳米离子作为SERS基底的研究也引起广泛关注。赵静晨等[41]利用表面活性剂合成树枝状结构的金纳米离子SERS基底。XU等[42]开发了金纳米棒SERS基底，均可以快速灵敏地检测鱼肉样品中的孔雀石绿残留。由于金属基底的成本较高，出现了金属与非金属组成的复合基底[43]。ZHAO等[44]在石英片上合成了金纳米离子与氧化石墨烯的复合基底，以结晶紫为探针，可以检测5种鱼类的孔雀石绿残留。除此之外，表面增强拉曼光谱也可与其他技术联用，实现便携式、手提式拉曼仪的开发。关琪等[45]制备了金纳米颗粒@多孔银纤维丝双功能基底，将固相微萃取技术与表面增强拉曼光谱联用，在电场作用下，可以在1 min内实现水产品中孔雀石绿及其代谢产物的富集和检测。

2.3 分子印迹技术

分子印迹技术可以通过模拟抗原-抗体间特异性结合模式制备三维网状结构聚合体，对靶分子进行选择性识别，其基本原理为“锁钥模型”，也被称为“仿生抗体”[46-47]。分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymer，MIP）性能稳定，特异性强，适用范围广，在食品检测中有良好的应用前景。表面印迹技术是最常用的分子印迹制备方法，在选定的载体材料表面形成分子印迹聚合物，常用的载体材料有磁性纳米粒子、碳纳米管等。章琦[48]利用多巴胺分子制备分子印迹材料，以磁性Fe3O4纳米颗粒固定孔雀石绿模板分子，形成磁性分子印迹聚合物，为检测孔雀石绿样品提供新的前处理方法。

量子点（Quantum Dots，QDs）是一种具有荧光的半导体纳米晶体材料，光化学稳定性强，利用其荧光特性制备的量子点荧光探针在食品、医学等方面的应用非常广泛，但量子点荧光探针对目标物的特异性较差，将量子点荧光探针与分子印迹技术结合形成复合材料，可以兼具高灵敏度和高选择性。RAN等[49]以MG为模板，采用不同的功能单体，以SiO2和聚苯乙烯微球（Polystyrene Microspheres，PS）为载体，CdTe QDs和碳点CDs为荧光光源，采用沉淀聚合法制备了核-壳结构MIP@SiO2@CdTe荧光分子探针，溶胶-凝胶法制备了核-壳结构比率荧光探针MTP@PS-QDs&CDs，反相微乳法制备双发射比率分子印迹探针MIPs@gQDs&rQDs，3种探针均能成功用于鱼肉样品中MG的检测。除了荧光型分子探针外，LUO等[50]合成了具有磷光性质的光学传感元件掺杂量子点Mn-ZnS QDS，通过反相乳液法将Mn-ZnS QDs与分子印迹聚合物结合，制备了能识别水和鱼类体内孔雀石绿的MIP-coated QDs，这种磷光分子探针可以避免样品基质中的背景荧光干扰，为样品中MG的检测提供了新思路。

2.4 分子识别技术

分子识别技术是指通过高特异性、高选择性的结合目标分子实现检测的分析方法，食品检测中常用的分子识别技术是基于抗原-抗体的酶联免疫法[51-52]。酶联免疫法可以与量子点、磁性纳米颗粒联用，使传统免疫检测方法的准确度和灵敏度不断得到提升。陈义元等[53]利用磁性纳米球与包被抗原偶联制备感应探针，以ZnCdS量子点作为标记物偶联孔雀石绿抗体制备信号探针，通过检测荧光强度建立了间接竞争荧光标记磁分离免疫分析方法，可以测定鱼类和虾肉中MG残留，检测限为0.012 μg/L。生物素-亲和素系统与ELISA结合，通过生物素标记，亲和素识别多个生物素，结合酶标记实现双信号放大，提升ELISA方法的灵敏度。杨光昕等[54]通过N-羟基琥珀酸生物素制备生物素化抗体，利用酶标记亲和素双重识别建立生物素-链霉亲和素放大酶联免疫吸附法，可以测定水产品中孔雀石绿和结晶紫含量。

随着核酸操控技术的飞速发展，多种体外技术克服了单克隆抗体技术的各种缺陷，出现了核酸适配体这种新型分子识别元件，是一种可以稳定结合目标抗原的单链RNA或DNA分子[55-56]。核酸适配体的目标分子范围极广，包括各种有机小分子、蛋白、组织和细胞等，具有高特异性、易于化学修饰、稳定性好等特点，在传感检测中具有广泛的应用前景[57]。近年来，以胶体金作为指示载体的比色核酸适配体传感器广泛应用于水产品中MG的检测。赵晨等[58]利用MG-RNA适配体结合胶体金建立可视化生物传感器检测方法，当样品中存在孔雀石绿时，检测溶液由红色变成蓝色，可实现定性和定量检测。吴文伟等[59]采用双特异性核酸适配体（Aptamer3，A3）作为传感探针，利用纳米金光学特性，比色法可同步检测水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿残留。这种方法具有操作简单、性能稳定、结果可视化等优点，比色核酸适配体传感器具有广泛的应用前景。

2.5 电化学传感器法

电化学传感器是利用待测组分电信号的变化进行检测，具有高灵敏度、高选择性及成本低等优点，已经成为药物残留检测的重要工具[60]。电化学法常以聚合材料及纳米材料制备电极。尚晶晶等[61]采用壳聚糖和石墨烯修饰玻碳电极，制备纳米修饰电极，以隐性孔雀石绿电化学性质测定水产品中2种孔雀石绿残留。电化学法可与分子印迹技术结合，陈宏等[62]用聚合邻氨基酚在玻碳电极表面制备分子印迹膜，构建了MG分子印迹电化学传感器，电极可以更好地捕获待测物，检测特异性高。

2.6 直读显色检测法

新型的直读显色的检测方法可实现现场快速分析，结合待测组分时会引起颜色显著变化，通过目视即可判断结果，具有成本低廉、操作简单等优点[63]。赖姝毓等[64]制备了碘酸钾@二氧化钛纳米复合显色材料，首次提出了基于薄层色谱图像分析的孔雀石绿半定量快速检测方法，为后期实现水产中MG的现场检测提供了新途径。

3 结语

对不同地区市售水产品中孔雀石绿污染情况的调查研究发现，虽然从膳食暴露水平评估风险较低，但是水产品的污染情况不容乐观，污染率偏高。相关部门要从源头加强监测力度，打击违法使用孔雀石绿的行为，不断提升对检测技术的要求。孔雀石绿及其代谢物检测技术不断发展优化，仪器法中超高液相色谱-串联质谱法得到了广泛应用，简单快速的敞开式电离质谱技术也日趋成熟，极大地简化了仪器法的检测流程；表面增强拉曼光谱无需前处理，可实现快速无损检测；分子印迹技术特异性强，制备简单，可与量子点、磁性粒子结合对目标分子进行高选择性检测；核酸适配体技术通过化学合成，在适宜的体外条件下筛选特定靶分子，与传统的抗体相比检测范围更广；电化学检测与传感器等新方法联用是一种快速准确的检测方法；新型的直读显色检测方法的出现也为孔雀石绿的即时检测提供了可能。各种新技术的出现及不同技术的相互融合扩大了检测方法的优势。在未来的检测中，操作简单、便于携带、检测快速及结果直观准确是今后技术的发展方向，量子点、纳米技术、核酸适配体及传感器技术等也将在未来的检测中被广泛应用。