二仙汤治疗早发性卵巢功能不全的网络药理学分析

李 敏 郭 淼 孙建华 翟凤霞 李 娜

(1 河南中医药大学，郑州，450046；2 河南中医药大学第一附属医院，郑州，450000)

早发性卵巢功能不全(Premature Ovarian Failure，POI)是指40岁之前的女性因卵巢功能减退而出现的一系列临床综合征，影响女性生育力及身心健康，其临床患病率为1%～3%[1]。目前，激素补充是西医临床主要治疗方案，即单纯雌激素治疗，雌孕激素序贯或连续联合治疗和阴道局部应用雌激素治疗[2]。这些治疗方案对调整月经周期，改善低雌激素状态，缓解并发症状具有一定的治疗作用，但在临床应用存在一定的禁忌证及潜在的血栓、肿瘤等风险[3]。

现代中医学家普遍认为该病虚实夹杂，但总以肾气亏损为基本病机。因此当以滋补肾气为主要治疗原则。二仙汤是第六批全国名老中医药专家王丽娜教授治疗POI的常用方，该方具有温肾阳，补肾精，交通心肾，调理冲任的功效。二仙汤联合西药治疗POI相较于单纯西药，在疗效及安全性方面，具有明显的优越性[4]。现代药理研究显示，二仙汤能够发挥抑制细胞凋亡，促进卵巢颗粒细胞增殖的作用[5-6]。

基于网络药理学的技术支持[7]，本研究旨在活性成分、核心作用靶基因及信号通路方面，系统阐释二仙汤作用于POI的作用机制，为进一步研究做准备。

1 资料与方法

1.1 筛选、获取二仙汤活性成分和靶基因 本研究借助中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php),以药物口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18为条件，筛选二仙汤的6味药物仙茅、淫羊藿、巴戟天、黄柏、知母、当归的活性成分[8]。并在该数据库中查询药物活性成分所对应的靶基因，建立药物靶基因数据集。

1.2 查询、收集疾病靶基因 将POI的英文名称“Premature Ovarian Insufficiency”分别输入在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)及GeneCards数据库(http://www.genecards.org/)进行查询，以获得POI相关的疾病靶基因，建立疾病靶基因数据集。

1.3 构建药物活性成分与作用靶基因的网络 利用ClusterProfiler软件包进行韦恩分析，取疾病靶基因与药物活性成分靶基因的交集，建立疾病-药物数据集，将该数据集与活性成分数据集共同导入Cytoscape 3.7.2软件，绘制药物活性成分与作用靶基因网络图，进行可视化。

1.4 预测二仙汤作用于POI的核心靶基因 将交集靶基因导入STRING数据库，获得二仙汤活性成分靶基因和POI相关靶基因的蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)，将数据导入Cytoscape 3.7.2，绘制PPI网络图，并筛选出核心靶基因。

1.5 二仙汤治疗POI的生物学过程与通路分析 采用ClusterProfiler软件包对作用靶基因先后进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析，并绘制通路图，进行可视化。

2 结果

2.1 二仙汤的活性成分筛选 得出92个活性成分，并将其作为候选化合物。这些成分相对应靶基因205个，整理活性成分靶基因数据集。

2.2 疾病靶基因筛选 通过OMIM、GeneCards数据库分别收集到靶基因392个、3 032个，去重后共计3 425个，整理为疾病靶基因数据集。

2.3 药物活性成分-作用靶基因网络图的构建与分析 由图1可知，有173交集靶基因，即为二仙汤治疗POI的作用靶基因。图2包括239个节点，代表药物活性成分和作用靶基因，1 153条边。二仙汤的主要活性成分为Stigmasterol(豆甾醇)、Kaempferol(山柰酚)、Beta-Sitosterol(Β-谷甾醇)、Luteolin(木犀草素)、Anhydroicaritin(淫羊藿苷元)、Quercetin(槲皮苷)等。

图1 二仙汤-POI靶基因韦恩图

图2 药物活性成分-作用靶基因网络图

2.4 二仙汤对POI核心靶基因的预测 结果显示：Degree值最大是36，最小是1。其中排名前4的基因是AKT丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT1)、促分裂原活化的蛋白激酶1(MAPK1)、活化蛋白(AP)-1转录因子亚单位(JUN)、核因子κB/p65(RELA)。见图3。

图3 二仙汤与POI的PPI网络

2.5 二仙汤治疗POI核心靶基因GO富集分析 生物过程(Biological Process，BP)条目1 939个，富集基因数量较大的有对营养水平的反应(Response to Nutrient Levels)、氧化应激反应(Response to Oxidative Stress)、对金属离子的响应(Response to Metal Ion)、对脂多糖反应(Response to Lipopolysaccharide)、对细菌源性分子的反应(Response to Molecule of Bacterial Origin)、类固醇激素反应(Response to Steroid Hormone)等。见图4。细胞组分(Cellular Component，CC)条目72个，富集基因数量较大的有膜筏(Membrane Raft)、膜微结构域(Membrane Microdomain)、膜区域(Membrane Region)、转录因子复合物(Transcription Factor Complex)、神经元胞体(Neuronal Cell Body)等。见图5。分子功能(Molecular Function，MF)条目141个，富集基因数量较大的有DNA结合转录激活剂活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性(DNA-Binding Transcription Activator Activity，RNA Polymerase II-Specific)、泛素样蛋白连接酶结合(Ubiquitin-Like Protein Ligase Binding)、细胞因子受体结合(Cytokine Receptor Binding)、受体配体活性(Receptor Ligand Activity)等。见图6。KEGG通路富集筛选得到164条信号通路，根据富集基因数量进行排序，选择前20个通路进行柱状图展示，其基因靶基因主要富集于Toll样受体信号通路(Toll-Like Receptor Signaling Pathway)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF Signaling Pathway)、低氧因子信号通路(HIF-1 Signaling Pathway)、T细胞受体信号通路(T Cell Receptor Signaling Pathway)等相关信号通路。

图4 作用靶基因的GO-BP分析气泡图(前20条)

图5 作用靶基因的GO-CC分析气泡图(前20条)

图6 作用靶基因的GO-MF分析气泡图(前20条)

2.6 二仙汤治疗POI信号通路的KEGG富集分析 图7X轴代表富集在信号通路上的基因数目，颜色代表富集的相关性。由图可知，主要涉及PI3K-AKT Signaling Pathway、MAPK Signaling Pathway、TNF Signaling Pathway等信号通路。

图7 作用靶基因的KEGG分析柱状图(前20条)

3 讨论

二仙汤通过包括槲皮苷、山柰酚、β-谷甾醇、豆甾醇、木犀草素等在内的66个有效成分作用于POI。槲皮苷是一种能促进卵泡发育和卵巢颗粒细胞增殖的黄酮类化合物，可促使雌激素分泌，以改善雷公藤多苷致POF动物模型的卵巢功能[9]。山柰酚也是在植物中提取的黄酮类化合物。有研究发现山柰酚可通过下调Notch胞内结构域(Notch Intracellular Domain，NICD)mRNA的表达，降低Notch1蛋白的表达而发挥抑制卵巢细胞SKOV-3细胞增殖，从而诱导其凋亡的作用[10]。曾莉萍等[11]研究观察到β-谷甾醇具有雌激素活性，具有诱导卵巢颗粒细胞分化，促进雌激素合成的作用。豆甾醇与β-谷甾醇同为植物甾醇类雌激素，具有降低血清中胆固醇水平的功能[12]，改善低雌激素水平下的心脑血管的功能。木犀草素在卵巢颗粒细胞的体外培养中，当其浓度达到12.5 μg/mL时，能促进卵巢颗粒细胞分泌雌激素[13]。

根据PPI网络可知，二仙汤治疗POI可能主要通过作用MAPK1、AKT1、JUN、RELA等靶标来发挥作用。细胞外因子激活MAPK，由此可将信号由细胞表面传送至细胞核内部。MAPK1基因蛋白在卵巢发育后期的前期卵巢中的表达明显增强，在卵母细胞及卵巢的发育和成熟过程中该基因可能起重要作用[14]。AKT1参与增殖、存活、生长等多种生物学过程。活化的蛋白激酶B可激发下游的叉头盒O类1A(Forkhead Box，Class O，1A，Foxo1a)mRNA的表达，从而影响卵巢颗粒细胞的增殖[15]。活化蛋白-1是有碱性亮氨酸拉链结构的JUN蛋白，在不同疾病中表现出上调或下调的表达。作为核因子κB家族的重要成员之一，RELA通过对靶的调节，发挥在颗粒细胞的增殖、凋亡、免疫应答等过程中相关作用[16]。

KEGG分析结果显示，二仙汤通过PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路等作用于POI。PI3K-AKT信号通路参与原始卵泡的发育、颗粒细胞的增殖和分化等生物过程[17]。促卵泡素促进颗粒细胞中蛋白激酶B的磷酸化，并通过PI3K-AKT信号通路抑制颗粒细胞凋亡[18]。MAPK信号通路对卵巢的颗粒细胞增殖发挥促进或抑制双面作用，即，各种因子可通过MAPK信号通路能够发挥对卵巢颗粒细胞上调、下调的作用[19]。国内回顾性研究发现POI患者血清中TNF-α水平低于正常水平，而在POI的发病过程中，TNF-α起着重要作用[20]。研究发现，加入TNF-α的卵泡内膜细胞,表现出更强的细胞增殖能力,即TNF-α能促进卵泡膜细胞增殖[21]。

综上所述，就活性成分、靶基因、信号通路三方面而言，二仙汤治疗POI是具有多途径的，这为之后开展动物与临床试验研究，提供一定的依据。