基于网络药理学和分子对接探讨沙参麦冬汤治疗肺癌的作用机制

李桂民 李耀辉 李 哲 曾 璐 见婷雯

(1 陕西中医药大学，西安，712046；2 陕西省中医医院，西安，710003；3 中国中医科学院发展研究中心，北京，100700)

肺癌是我国乃至世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一[1]，据全球肿瘤统计数据(GLOBOCAN)估计2018年全球有209万肺癌新发患者占癌症发病总数的11.6%，以及176万死亡患者占癌症总数18.4%[2]，我国癌症中心估计每年新发肺癌约为78.7万例，死亡约为63.1万，发病率和死亡率居所有癌症的首位[3]。证据研究表明吸烟、职业接触致癌物、空气污染、既往肺部疾病等都会增加患肺癌风险，其中吸烟是最主要的肺癌致病因素[4]。早期肺癌患者临床症状不明显，筛查诊断难度大，肺癌发现后多为中晚期且预后极差，接受一线化疗肺癌患者的总生存率中位数为7～12个月，肺癌严重威胁人类的生命健康[5]。目前手术治疗、放疗、化疗、靶向治疗是肺癌主要治疗手段，但这些方法对中晚期患者都不能达到较好疗效。同时放化疗靶向治疗给患者带来疼痛、恶心呕吐、厌食、乏力、便秘、骨髓抑制等严重不良反应，同时大部分患者伴有恐惧、焦虑、抑郁等精神问题，这些都严重影响患者预后[6]。因此减少患者痛苦、延长生存周期、改善生命质量是肺癌治疗重要方向。中药联合放化疗很好切合了这一方向，使更多患者受益。

沙参麦冬汤出自清代名医吴鞠通的《温病条辨》，全方由沙参、麦冬、玉竹、天花粉、扁豆、甘草、桑叶组成，是清养肺胃、生津润燥代表方剂。肺癌中医证候梳理显示放化疗及靶向治疗患者多以阴虚内热、气阴两虚多见，沙参麦冬汤是益气养阴良方，临床研究证实可以有效改善肺癌患者临床症状[7]。现代药理学研究表明沙参麦冬汤可以减少化疗药物导致的不良反应，提高患者免疫功能，下调血清缺氧诱导因子-1α、诱生型一氧化氮合酶、血管生成素-2水平，改变肿瘤基因表达[8-9]。患者不良反应降低，治疗耐受性提高达到更好的治疗效果。现为进一步研究沙参麦冬汤治疗肺癌的药物作用机制，本研究通过网络药理学筛选沙参麦冬汤的主要活性成分、作用靶点、信号通路及潜在网络关系，探讨其治疗肺癌的作用机制。

1 资料与方法

1.1 沙参麦冬汤成分与靶点收集 通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)数据库[10]，检索沙参、麦冬、玉竹、天花粉、扁豆、甘草、桑叶全部化学成分，以口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%、类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18为条件筛选主要成分并收集化合物对应靶点，由于TCMSP数据库获得“扁豆、玉竹、天花粉”成分较少，且没有“麦冬”化学成分，故通过中医分子机制生物学信息分析工具(BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[11]进行补充，以Score cutoff≥20且P-value cutoff<0.05为筛选条件。将2个数据库得到的成分靶点去除重复后合并，得到沙参麦冬汤的成分靶点数据集，借助UniProt(https://www.uniprot.org)数据库对基因名进行标准化处理[12]。

1.2 肺癌靶点收集 以“Lung Cancer”“Small Cell Lung Cancer”“Non-Small Cell Lung Cancer”为疾病检索词，分别在GeneCards(https://www.genecards.org)、在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http://www.omim.org)、DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca)进行搜索，收集肺癌疾病相靶点。

1.3 “活性成分-靶点”网络图的绘制 将获取的成分靶点与疾病靶点通过Venny2.1.0平台进行映射得到交集靶点，运用Cytoscape 3.8.0软件绘制“活性成分-靶点”网络图，并根据度值(Degree)，筛选出沙参麦冬汤核心成分。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络的构建 将共有基因导入STRING(https://string-db.org)数据库获取蛋白相互作用关系并构建PPI网络，将获得的TSV文件导入Cytoscape利用CytoNCA内置插件进行网络拓扑分析，最终得到核心蛋白。

1.5 基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析 将成分与疾病共有靶点录入Metascape(http://metascape.org/gp/index.html)平台[13]，分析其主要的生物学过程与代谢通路并进行富集分析，并对数据进行可视化处理。将富集分析结果导入Cytoscape绘制“方剂-活性成分-交集靶点-肺癌-信号通路”图。

1.6 分子对接 计算“活性成分-靶点”网络图中活性成分的度值，将Degree>25的6个活性成分与查阅文献后保留6个密切度高的核心蛋白进行分子对接，在PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获取活性成分的2D结构，并借助Chem3D软件进行结构优化。PDB(http://www.rcsb.org)数据库获取蛋白结构，通过AutoDockTools软件进行处理蛋白和小分子配体，AutoDock-Vina进行分子对接计算结合能，Pymol进行数据可视化处理。

2 结果

2.1 沙参麦冬汤活性成分与靶点筛选 通过TCMSP数据库共获得活性成分141个，其中沙参9个、玉竹8个、扁豆1个、桑叶29个、天花粉2个、甘草92个，TCMSP数据库未收录麦冬。在BATMAN-TCM检索麦冬20个活性成分，因扁豆、玉竹、天花粉检索成分较少，所以通过BATMAN-TCM予以补充，其中扁豆10个、玉竹12个、天花粉8个。整合2个数据库删除重复成分，因此共获得沙参麦冬汤活性成分192个，对应靶点3 585个，删除重复值后对应化合物靶点有866个。

2.2 肺癌靶点整合 将3个数据库检索的肺癌靶点进行整合，OMIM获得508个，GeneCards获得11 573个，根据文献经验Score值越大相关性越强，通过(Relevance Score≥16.85)筛选获得1 450个，DrugBank获得310个，去除重复值得到1 910个疾病基因。将疾病基因与药物靶点取交集，获得共有基因191个。见图1。

图1 药物-疾病交集靶点韦恩图

2.3 “中药-活性成分-靶点网络图”的分析 将191个共有靶点使用Cytoscape 3.8.0构建的“中药-活性成分-靶点”网络图包含330个节点，1 750条边。并通过内置数据分析计算出每个节点的度值(Degree)，度值越大则表示该化合物发挥治疗作用的可能越大。通过网络分析筛选出度值最大的10个成分。化合物为:Quercetin、Stigmasterol、Beta-Carotene、Kaempferol、Beta-Sitosterol、Glabrene、Naringenin、Arachidonic Acid、Formononetin、Glabridin。见表1。因此我们预测上述10个化合物可能是沙参麦冬汤治疗肺癌的重要成分。见图2。

表1 度值前10活性成分

图2 “中药-活性成分-靶点”网络

2.4 PPI网络构建与分析 将获得的数据录入Cytoscape进行网络分析，得到106个节点，742条边。平均Degree值为7，PPI网络图Degree值越大颜色越深节点越大。见图3。CytoNCA是蛋白互作网络集中性分析和评估的算法之一,使用CytoNCA插件对核心聚类蛋白进行分析，以Betweenness、Closeness、Degree、Eigenvector、Information、LAC等6个值为筛选条件,筛选流程见图4。经过2次筛选得到10个基因核心互作网络。见表2。

图3 PPI网络

图4 CytoNCA筛选流程

表2 CytoNCA核心蛋白

2.5 GO富集分析 借助Metascape数据库进行GO富集分析，得到2 684条生物过程(BP)，主要与无机物的反应、血管发育、凋亡信号通路、细胞死亡的正调控、细胞增殖负调控、细胞分化负调控等功能有关；得到117条细胞组分(CC)，主要与转录因子复合物、死亡诱导信号复合物、细胞体、细胞外基质、早期内小体、细胞质核周区等有关；得到210条分子功能(MF)，主要与转录因子结合、激酶结合、蛋白质同聚活性、细胞因子受体结合、蛋白酶结合、蛋白质结构域特异性结合等功能相关。根据富集基因数目绘制柱状图。见图5。

图5 交集靶点GO富集分析

2.6 KEGG通路分析 使用Metascape数据库进行KEGG富集分析，得到366条富集通路，结果显示基因主要富集在癌症途径、TNF信号通路、蛋白多糖在癌症中的作用、癌组织中的微RNA、铂耐药、肿瘤的转录调控失调、核因子κB信号通路等信号通路。见图6。使用Cytoscape绘制“沙参麦冬汤-活性成分-关键靶点-肺癌-信号通路”见图7。

图6 交集靶点KEGG富集分析

图7 “沙参麦冬汤-活性成分-关键靶点-肺癌-信号通路”网络图

2.7 分子对接分析 为了进一步探讨沙参麦冬汤对肺癌的作用关系，借助AutoDock Vina软件进行分子对接，将度值最高的6个活性成分(Quercetin、Stigmasterol、Beta-Carotene、Kaempferol、Beta-Sitosterol、Naringenin)与6个密切度最高的蛋白(STAT3、MAPK14、TP53、TNF、IL-6、MYC)进行分子对接。据有关文献研究成分与蛋白结合自由能小于-5 kcal/mol(1 cal=4.184 J)认为二者结合稳定[14]。结果显示活成成分与蛋白结合能均小于-5 kcal/mol。见表3。以上对接结果表明了沙参麦冬汤中活性成分与肺癌的靶点基因有着很好的结合作用。

表3 核心活性化合物与核心蛋白结合能(kcal/mol)

图8 部分蛋白和活性成分分子对接图

3 讨论

肺癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤，沙参麦冬汤联合放化疗治疗肺癌有独特优势。现代药理研究表明麦冬汤具有提高人体免疫力、保护胃黏膜、抗炎、抗肿瘤的作用[15]。通过上调Smad7信号变大与抑制TGF-β1信号通路，减缓肿瘤微环境及肿瘤血管生成，而控制人类癌细胞的生长、黏附和转移[16]。降低患者白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α水平，减轻炎症反应[17]。提高患者CD3+T、CD4+T淋巴细胞比例，提高CD4+/CD8+T淋巴细胞比值，提高患者免疫力，减轻患者恶心、呕吐、腹泻、食欲不振、乏力等不良反应[9,18-19]。

本研究通过对沙参麦冬汤的活性成分筛选，发现槲皮素、豆甾醇、β-胡萝卜素、山柰酚、β-谷甾醇、柚皮素、花生四烯酸等化合物分子与肺癌的靶点具有高度活性。基础研究报道槲皮素具有抑制肿瘤细胞传导、增强化疗敏感性、诱导肿瘤细胞凋亡或自噬等作用，通过激活AMPK-mTOR信号通路，促进肺癌细胞株A549细胞自噬抑制细胞增殖[20]。抑制ADAM9(解整联蛋白和金属蛋白酶家族成员)的表达，降低肺癌细胞的侵袭能力，促进组织纤溶酶原激活物介导的迁移蛋白的裂解抑制细胞迁移和侵袭，还可以抑制肿瘤骨转移并延长寿命[21]。豆甾醇具有抗炎、抗氧化、抗癌的药理作用，抑制肝癌细胞的增殖并诱导其凋亡，降低肿瘤坏死因子-α的转录，破坏肿瘤血管生成抑制胆管癌生长，通过抑制JAK/STAT信号通路，降低胃癌细胞增殖迁移，与肺癌的关联性有待研究证明[22]。β-胡萝卜素具有抗氧化作用，通过抑制细胞核分裂，诱导肺癌YTMLC-90细胞凋亡[23]，调节DNA甲基化，修复DNA损伤，增强抗肿瘤免疫反应，同时摄入β-胡萝卜素可以降低患肺癌的风险[24]。山柰酚是一种可以抑制肿瘤发生的饮食类黄酮，研究证明山柰酚抑制肺癌A549细胞形成和损伤修复，通过TGF-β通路降低癌细胞侵袭和迁移能力[25]，调节miR21/PTEN信号通路抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖[26]。上调miR-340的表达使PI3K/AKT通路失活而抑制肺腺癌A549细胞增殖，诱导细胞凋亡和自噬[27]。β-谷甾醇抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用[28]。柚皮素通过P38 MAPK通路诱导细胞肺癌发生氧化应激反应，使A549细胞产生凋亡和增殖抑制[29]，抑制TNF-α的血管平滑肌细胞因子，限制肿瘤细胞生长并诱导癌细胞凋亡[30]。由此可见，这些活性成分通过影响癌细胞周期、凋亡、增殖、侵袭，血管生成、转移和炎症等多途径实现抗癌作用，是沙参麦冬汤治疗肺癌的主要物质基础。

研究基于网络药理学将获得的191个疾病药物共有靶点进行PPI核心网络分析，得到10个关键靶点为JUN、MAPK8、MYC、MAPK14、STAT3、MAPK1、RELA、TP53、IL-6。其中MAPK8、MAPK14、MAPK1皆为促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK)家族蛋白。MAPK调控异常与肿瘤细胞增殖、转移及侵袭密切相关[31]。JUN是活化蛋白-1(Activating Protein-1,AP-1)转录因子的关键亚基，在调节细胞增殖和分化中起着至关重要的作用，与多种蛋白和信号通路直接相互作用使癌细胞的增殖抑制[32]。信号转导及转录激活因子(Signal Transduction and Activator of Transcription，STAT)3的激活与恶性肿瘤之间的关系十分密切，是致癌信号转导通路中的重要分子，直接参与肺癌的发生发展[33]，提高肺癌细胞对顺铂的敏感性。肿瘤蛋白P53(Tumor Protein P53，TP53)是肿瘤相关性较高的抑癌基因，在肺癌中易发生基因突变，破坏肿瘤抑制因子的功能，对临床用药和预后具有指导意义[34-35]。MYC可以消除干扰素反应性的障碍，增强T细胞的吸引力，并引起直接的抗肿瘤细胞增殖作用[36]。沙参麦冬汤的以上靶点发挥了对肺癌的治疗功效，分子对接验证了筛选的有效成分和蛋白靶点之间密切结合。

在KEGG候选靶标的通路富集分析中，蛋白多糖在癌症中充当癌症生物学的负调节剂，抑制生长信号转导影响细胞增殖，作用于血管内皮生长因子信号转导，调节肿瘤中的血管生成[37]。作用于上皮细胞黏附分子从而在调节癌细胞的黏附和迁移[38]。TNF信号通路属肿瘤坏死因子超家族。参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生物过程的调节。研究表明微RNAs参与了肺癌的发病机制，参与细胞生长、凋亡、发育和分化等多种生物学过程[39]。微RNA-134被证明能调节细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转换，降低EGFR的表达抑制肿瘤生长。可作为表皮生长因子受体靶向治疗的抗肿瘤药物[40]；微RNA-34a通过调节Bcl-2、SIRT1、E2F3、Fra-1通路能够诱导细胞凋亡，抑制细胞迁移和肿瘤生长[41]；微RNA-31通过靶向BAP-1mRNA降低BAP-1蛋白水平，诱导肺癌增殖和抑制凋亡[42]。微RNA15/16直接调节肺癌细胞周期蛋白D1、D2和E1，诱导细胞周期G1期阻滞[43]，微RNA-16通过靶向Bcl-2使对紫杉醇耐药肺癌细胞重新敏感[44]。核因子κB信号通路与恶性肿瘤的发展关系密切，能抑制肿瘤细胞增殖、转移、干预炎症，过度活化干扰肿瘤微环境，改变肿瘤细胞生物学特征，加剧肿瘤发展[45]。

综上所述，沙参麦冬汤治疗肺癌的作用机制，是中药复方多成分、多靶点、多通路、协同治疗的过程，沙参麦冬汤可能通过槲皮素、豆甾醇、山柰酚等成分与STAT3、MAPK1、TP53等蛋白结合，通过蛋白多糖、微RNA、肿瘤的转录调控失调等信号通路，通过影响细胞周期、凋亡、增殖、自噬，肿瘤血管生成，肿瘤细胞转移，减少炎症反应，提高机体免疫能力，提高化疗药物敏感性等多方面达到肺癌协同治疗作用。