肝细胞癌肿瘤免疫微环境中T淋巴细胞的功能与调控机制

韩孟奎，李 晋，杨小华

1 苏州大学附属第一医院 普通外科，江苏 苏州 215031；2 苏州市第五人民医院 检验中心，江苏 苏州 215131

肝细胞癌(HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，占原发性肝癌的75%～85%[1]。在肝癌早期阶段，肝切除或肝移植是标准治疗手段，术后5年生存率可达70%；而对于多数失去手术机会的晚期患者，尽管采取局部消融、放疗和分子靶向治疗等非手术疗法，肝癌的5年总体生存率仅为18%[2]。近年来，随着对肿瘤免疫微环境(tumor immune microenvironment，TIME)研究的不断深入，肿瘤免疫治疗相关研究和临床实验取得较大进展，HCC晚期患者的非手术治疗有了更多选择。TIME主要由免疫细胞、基质细胞、细胞因子和物理成分等组成，其中T淋巴细胞作为主要的免疫细胞，在TIME调控中发挥肿瘤清除、细胞因子分泌等多重效应[3]。本文对参与肝癌TIME中T淋巴细胞功能调控的关键免疫细胞和信号通路的研究现状及进展进行综述，为进一步研究TIME免疫调控反应对HCC发生发展的作用以及未来肝癌免疫治疗策略提供理论依据。

1 TIME中主要T淋巴细胞亚型及作用机制

T淋巴细胞作为TIME中的关键免疫细胞，其中CD8+T、CD4+T、调节性T淋巴细胞(Treg)等亚群在肝癌发生发展、免疫治疗等领域受到广泛关注。CD8+T淋巴细胞是肿瘤研究领域最受关注的T淋巴细胞亚群。研究[4]表明，HCC肿瘤组织中CD8+T淋巴细胞可分化为细胞毒性T淋巴细胞，继而产生细胞因子和细胞毒性酶(穿孔素、颗粒酶B)从而清除癌细胞并可发展为记忆T淋巴细胞。也有研究[5-6]指出肿瘤组织中高浸润CD8+T淋巴细胞提示HCC患者高复发率和预后不良，其机制可能是在长期抑制性TIME的背景下，肿瘤特异性CD8+T淋巴细胞容易进入“T淋巴细胞耗竭”阶段，表现为淋巴细胞活化基因3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)、细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)、T淋巴细胞免疫球蛋白3(T cell immunoglobulin-3，TIM-3)等细胞表面抑制性受体表达增加，细胞因子如IL-2、TNFα、IFNγ的产生和肿瘤杀伤能力受损。综上可知，浸润的CD8+T淋巴细胞能够通过增强机体抗肿瘤免疫功能，缓解或控制肿瘤的进程，与HCC良好的预后相关。

除CD8+T淋巴细胞外，CD4+T淋巴细胞也被证明在控制肿瘤进展中发挥重要作用。研究[7]表明，在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的小鼠模型中，诱导CD4+T淋巴细胞凋亡可以促进HCC的发生。首先，CD4+T淋巴细胞能通过分泌细胞因子和激活CD8+T淋巴细胞从而发挥免疫功能。同时，幼稚CD4+T淋巴细胞可在特定细胞因子诱导下表达T-bet、GATA-3和Bcl6等转录因子，进而分化为Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh等多种亚群[8]。此外，在抗肿瘤反应中也可检测到具有细胞毒性的CD4+T淋巴细胞，提示这些细胞可能在体内表现出与CD8+T淋巴细胞互补的功能，共同发挥抗肿瘤效应[9]。综上所述，肿瘤组织中CD4+T浸润减少或功能受损能够引起CD8+T淋巴细胞功能受损并与HCC预后不佳相关。

作为一类调节自身免疫反应的T淋巴细胞亚群，Treg在HCC肿瘤免疫过程中发挥重要作用。Huang等[10]的Meta分析证明在HCC患者中，高Treg浸润组的1、3、5年生存率比低Treg浸润组要差。首先，Treg作为免疫抑制和抗炎细胞，可以抑制各种细胞因子(如IL-6、IL-17)对T淋巴细胞的作用[11]。其次，Treg还能通过高表达相关免疫抑制分子(LAG-3、TIM-3等)抑制效应T淋巴细胞抗肿瘤功能[12]。当前研究表明，高Treg浸润与HCC预后不良相关，Treg对肝癌预后调节的具体机制还有待进一步研究。

2 TIME中影响T淋巴细胞功能的关键免疫细胞及作用机制

树突状细胞(DC)作为抗原递呈细胞，因能够在摄取、加工和处理肿瘤抗原后特异性激活T淋巴细胞，普遍认为与HCC患者预后良好相关。然而，有研究表明CD14+CTLA-4+DC可以产生IL-10和吲哚胺2，3双加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase，IDO)，从而抑制CD4+T淋巴细胞免疫反应[13]，并诱导Treg在肿瘤区域的增殖分化进而促进HCC进展[14]。同时，Treg可诱导DC表达IDO，进而抑制T淋巴细胞反应并促进免疫耐受[15]。此外，有研究[16]证实CD4+、CD8+T淋巴细胞表面的抑制受体如程序性死亡受体-1(programmed cell death protein-1，PD-1)、TIM-3、CTLA-4在肿瘤组织中的表达高于非肿瘤组织和外周血，这些抑制受体能与DC抑制配体结合，诱导CD4+T淋巴细胞功能异常或抑制CD8+T淋巴细胞的细胞毒性反应(图1)。因此，由于对效应T淋巴细胞的抑制功能增加，DC也被证明与HCC患者的不良结局相关。

巨噬细胞是肝组织中重要免疫细胞，在肝癌TIME中发挥作用的主要为M1(IFNγ、脂多糖诱导)和M2(IL-4、IL-13诱导)两种亚型。一方面，Yu等[17]研究表明，TIME中 M1巨噬细胞能够通过释放一氧化氮(nitric oxide，NO)，增加抗肿瘤因子IL-12、TNFα、IFNγ的产生；同时，极化的M1巨噬细胞下调免疫抑制因子IL-10和TGFβ的表达，促进CD8+T淋巴细胞和CD4+Th1细胞的招募和激活，促进抗肿瘤反应[17]。另一方面，由趋化因子CCL2/CCR2R轴诱导的M2巨噬细胞可通过分泌各种抑制因子和趋化因子如IL-6、巨噬细胞炎性蛋白-1(macrophage inflammatory protein 1，MIP-1)、巨噬细胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)抑制CD8+T淋巴细胞增殖进而促进肿瘤进展[18]。也有研究[19]表明，M2巨噬细胞可以通过上调miR-21-5p表达，激活YAP/β-catenin通路促进CD8+T淋巴细胞表面抑制性受体(PD-1、TIM-3)表达和减少抗肿瘤因子(IFNγ、IL-2、TNFα)产生抑制抗肿瘤反应。同时，M2巨噬细胞也可分泌IL-10或在缺氧情况下通过ERK/NF-κB通路促进Treg在肿瘤部位积累[20]。Peranzoni等[21]研究表明巨噬细胞还可以形成相对静态的细胞网络以减少CD8+T淋巴细胞在肿瘤组织浸润(图1)。当前研究表明，肝癌TIME中浸润的主要是促进肿瘤进展的M2巨噬细胞，该种巨噬细胞能够通过影响T淋巴细胞功能来促进免疫耐受和癌细胞增殖、转移来维持HCC的发生和发展。

髓样抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)被称为肿瘤调节的关键免疫细胞，在HCC肿瘤免疫过程中能够表现出抑制T淋巴细胞功能和促进肿瘤发生的能力。首先，癌细胞能够产生大量活性氧导致补体C3分泌，诱导MDSC通过P38/MAPK途径产生IL-10抑制CD8+T淋巴细胞的增殖和激活[22]。其次，MDSC可以通过PD-1/PD-L1通路、精氨酸酶-Ⅰ(Arginase-1)的表达来抑制CD8+T淋巴细胞的功能或诱导T淋巴细胞凋亡[22-23]。除上述致瘤活性外，MDSC还能通过IL-10、TGFβ、TNFγ诱导肿瘤组织中Treg的分化从而促进肿瘤发生和发展[24](图1)。上述研究表明，MDSC在HCC中起到促进肿瘤进展的作用，充分研究MDSC-T淋巴细胞免疫抑制轴或许能为HCC靶向治疗提供创新途径。

B淋巴细胞作为TIME细胞成分之一，在HCC进展中的作用仍有待进一步探究。有研究[25]指出肿瘤边缘区域CD20+B淋巴细胞的增加与HCC的良好预后相关。根据Shi等[26]的研究，浸润B淋巴细胞可以产生IFNγ和IL-12p40来刺激CD8+T淋巴细胞发挥肿瘤直接杀伤作用，同时促进Th1免疫反应而产生强大的抗肿瘤活性。Garnelo等[27]研究发现在B淋巴细胞耗尽时，CD8+T淋巴细胞上的PD-1表达上调，这表明CD8+T淋巴细胞的激活受到CD20+B淋巴细胞的调节。也有研究[28-29]表明，调节性B淋巴细胞(regulatory B cell，Breg)可通过分泌TGFβ和IL-10限制Th1和Th2的发育并促进Treg分化来负向调节免疫反应，并导致CD4+T淋巴细胞耗竭和CD8+T淋巴细胞免疫功能受损(图1)。多数研究显示，B淋巴细胞对于不同亚群T淋巴细胞的调节作用主要取决于HCC TIME的变化阶段，因而还需进一步深入研究相关调节机制。

图1 HCC免疫微环境中T淋巴细胞及其相关免疫细胞的调控作用及分子机制

3 TIME中影响T淋巴细胞功能的关键信号通路及调控机制

Wnt/β-catenin通常位于细胞连接处和细胞质中，该通路突变在HCC中频繁发生。首先，趋化因子CCL5在β-catenin信号驱动中表达上调导致HCC TIME中DC和特异性CD8+T淋巴细胞水平显著提高，而CCL5下调能够引起该信号通路的免疫抑制[30]。Wnt/β-Catenin信号通路激活会扰乱CD8+T淋巴细胞的作用，诱导TIME中耗竭CD4+或CD8+T淋巴细胞数量增加，有助于建立肿瘤免疫抑制[31]。同时，β-catenin信号通路还可以通过上调T淋巴细胞表面抑制性受体PD-1的表达进而抑制CD8+T淋巴细胞毒性和浸润水平[19]。Zhu等[32]研究表明，抑制Wnt/β-catenin途径激活能够促进HCC肿瘤组织招募更多的CD8+T淋巴细胞，显著改善PD-1阻断治疗效果。总之，Wnt/β-catenin信号通路能够在HCC进展中频繁激活，并通过调节肿瘤相关T淋巴细胞功能来促进肿瘤进展。

TGFβ通路是一个由细胞膜到细胞核的经典信号传导过程，在HCC中，TGFβ通路能通过T淋巴细胞来调节肿瘤的进展。首先，TGFβ能够通过调节TBET、STAT4两种转录因子的表达，抑制幼稚T淋巴细胞向Th1分化或通过激活SMAD依赖途径来介导Treg的分化形成促进肿瘤进展[33]。其次，TGFβ能够通过由Smad蛋白家族中Smad3、Smad4与辅助因子TOB1共同介导的路径抑制CD4+T淋巴细胞增殖；或使T淋巴细胞线粒体中Smad蛋白磷酸化，通过调节能量代谢抑制T淋巴细胞增殖和免疫功能[34-35]。此外，TGFβ还能够通过Smad3选择性地增强PD-1基因转录，上调PD-1在CD8+T淋巴细胞上的表达，诱导CD8+T淋巴细胞耗竭促进HCC进展[36]。另一方面，TGFβ能够通过肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts，CAF)抑制Treg在肿瘤微环境浸润[37]。TGFβ还能够上调αE和β7亚单位在HCC肿瘤组织中的表达，促进记忆CD8+T淋巴细胞在肿瘤组织中驻留，增强肿瘤免疫功能。研究表明，TGFβ信号通路广泛参与T淋巴细胞的功能调节，并在HCC中主要发挥促进肿瘤进展的作用。

另外，其他相关信号通路，包括JAK/STAT、VEGF等在HCC TIME中也发挥着重要作用。研究[38]表明，约60%的肝癌组织样本中可以检测到磷酸化的STAT3，且多与预后不良有关。一方面，HCC肿瘤细胞和CAF分泌的IL-6可以与DC上的IL-6R结合，启动STAT3通路的下游磷酸化级联反应，以抑制T淋巴细胞增殖并增加Treg的产生[39]。另一方面，IL-12可以通过STAT4信号通路增加抗凋亡基因的表达并能够减少促凋亡基因在T淋巴细胞中的表达[40]。HCC肿瘤组织缺氧可以诱导VEGF产生，该通路不仅可以通过诱导免疫抑制受体(PD-1、TIM-3)的表达来介导CD8+T淋巴细胞耗竭，还可通过诱导Fas配体的表达降低CD8+T淋巴细胞毒性并引起细胞耗竭[41]。

TIME中与T淋巴细胞相关的信号通路在HCC发展过程中发挥着关键调控作用，所涉及机制仍然有待进一步研究。

4 基于T淋巴细胞的免疫疗法在HCC中的应用

免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICI)作为新型的肿瘤治疗模式，能够显著改善肿瘤患者的临床预后。目前正在广泛研究的HCC相关免疫检查点有PD-1、CTLA-4、LAG3和TIM-3等。一项纳入262例患者的研究[42]评估了尼伏伦布(PD-1单抗)在晚期HCC患者中的效果，结果显示尼伏伦布具有良好的安全性和有效性[客观缓解率(objective response rate，ORR)=20%]。Agdashian等[43]研究发现，CTLA-4阻断剂tremelimumab可以引起肿瘤特异性T淋巴细胞的激活以及促进CD8+T淋巴细胞肿瘤浸润。尽管当前单一ICI疗法在HCC治疗中取得一定的成果，但其有效率(10%～20%)仍不能令人满意[44]。因此，有研究[45]将CTLA-4抑制剂与PD-1抑制剂相结合用于治疗HCC患者，数据表明ICI联合治疗有可能在免疫治疗中实现协同效应，增强抗肿瘤反应。

过继细胞转移疗法(adoptive cell transfer-based therapies，ACT)由于能够提供持续抗肿瘤能力，在HCC免疫疗法的研究中引起高度关注。目前基于ACT的HCC治疗主要包括细胞因子诱导的杀伤细胞疗法(cytokine-induced killer，CIK)和嵌合抗原受体修饰T细胞疗法[46]。在一项评估由IL-2和CD3抗体孵育的CIK细胞作为HCC辅助治疗有效性的试验[47]中，CIK细胞治疗能够延长患者无复发生存时间，免疫治疗组相比对照组为44.0 vs 30.0个月。Szoor等[48]发现，在小鼠肝癌异种移植模型中，GPC3-CAR-T淋巴细胞能够有效地抑制高度表达GPC3+的肿瘤细胞生长，显示出强大的抗肿瘤活性。以下为已注册的采用CAR-T疗法对HCC患者进行临床实验的项目编号：NCT02723942、NCT02395250、NCT03084380、NCT02541370、NCT03899415(ClinicalTrials.gov)。

肿瘤疫苗是利用肿瘤自身相关抗原，如AFP、GPC3、人端粒酶反转录酶等刺激免疫系统，促进幼稚T淋巴细胞增殖和抗原特异性T淋巴细胞产生，进而有效诱导机体对HCC产生特异性免疫反应。Li等[49]使用腺相关病毒载体将AFP转移到DC细胞中刺激产生DC衍生外泌体，这些外泌体不仅能够促进幼稚T淋巴细胞增殖和抗原特异性T淋巴细胞产生，还可以有效诱导机体对HCC的特异性免疫反应。一项以评价GPC3衍生的多肽疫苗疗效的二期试验[50]显示，对比只接受手术的患者，同时接受疫苗接种和手术的HCC患者术后1年复发率下降15%，5年和8年生存率分别提高了10%和30%。

值得注意的是，尽管基于T淋巴细胞的肿瘤免疫疗法提高了HCC治疗的反应率，但仍有多数患者未能从这种有前景的治疗中受益。因此，迫切需要发现新的HCC免疫治疗靶点，以提高肿瘤免疫治疗效果。

5 总结与展望

综上所述，在多种信号通路及B淋巴细胞、DC等细胞调节下，T淋巴细胞作为TIME中主要成分，对于HCC免疫耐受的形成有重要作用。随着对TIME在HCC发生机制及治疗作用中的研究不断深入，理解与肿瘤免疫相关的T淋巴细胞亚群及其分子机制将有利于开发出新的治疗策略，提高HCC患者免疫治疗的有效性和安全性。但目前关于HCC TIME的研究尚未完全明晰：首先，多数已报道的数据主要聚焦于HCC外周血中T淋巴细胞亚型及相关功能，而TIME中T淋巴细胞功能由肿瘤细胞、免疫细胞、细胞外基质和细胞因子等多种因素共同影响，因此尚缺乏对肝癌组织原位免疫细胞相互作用的机制研究。其次，肝脏是一个相对免疫豁免的器官，T淋巴细胞介导的免疫反应是肿瘤监测和清除的核心，如何增强T淋巴细胞对肝癌细胞的特异性免疫反应仍然有待进一步研究。最后，由于现有免疫疗法对于癌细胞杀伤的局限性和单一性，以致HCC仍存在复发和进化的可能，目前基于T淋巴细胞的免疫疗法所获得的临床疗效仍十分有限。因此，更加深入地了解肝癌TIME，增进对不同亚群T淋巴细胞功能的认识，将对于阐明HCC免疫调控机制和研发更有效的治疗手段具有重要意义。

利益冲突说明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：韩孟奎负责文献资料收集分析，论文撰写；李晋负责论文修改，对文章的知识性内容做出批评性审阅；杨小华负责指导撰写论文并最后定稿。