小米苦荞米酒加工工艺优化

贺祺涵，赵江林*，林昱吉，严慧玲，陈剑雄，赵钢

（1.成都大学四川省杂粮产业化工程技术研究中心，四川 成都 610106；2.环太生物科技有限公司，四川 成都 610213）

小米[Setaria italica var.germanica（Mill.）Schred.]是一种杂粮作物，含有丰富的碳水化合物、蛋白质及VB1、VB2和烟酸等多种人体必需元素，利于人体吸收，具有抗氧化、滋阴补脾等功效，是人体良好的营养来源之一[1-3]。苦荞又名鞑靼荞麦（Fagopyrum tataricum），是一种可为人类提供优质营养，具有较好食用价值及保健功能的食药两用特色杂粮[4-8]。苦荞中的蛋白质、淀粉及黄酮类化合物含量较丰富，具有明显的降血糖、降血压和降血脂等功效，是当前健康食品领域的研究开发热点之一[9-10]。

米酒属于低度酒精饮料，是我国的传统风味食品。传统米酒主要选用糯米进行制作，在发酵过程中可产生各类多糖、氨基酸，具有补气益血、消肿利尿的作用。此外，经发酵而成的米酒更有利于人体消化吸收，具有极大的开发价值及市场前景[11-12]。根据米酒的糖化工艺及发酵添加物的不同，可将其分为保健型、果蔬型、鲜花型和复合型米酒4大类[13]。近年来随着生活水平的逐渐提高和健康意识的增强，人们对各类食品的品质追求也越来越高，兼具高营养价值及保健功能的低酒精度饮料则更加受到消费者的青睐[14-19]。目前市面上出现的米酒种类较单一，国内外对各类复合型米酒的开发研究相对较少，这在一定程度上限制了米酒产业的健康发展。目前国内外关于小米苦荞米酒的研究鲜见报道。基于此，本研究特以小米、苦荞和糯米为主要原料，对其原料配比、发酵条件等进行筛选优化，同时对其品质和功能活性进行评价，以期开发出一款风味独特、营养丰富，并具有一定功能活性的新型米酒类饮品，从而为丰富米酒种类，提升小米、苦荞等特色杂粮的加工技术水平和附加值提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

糯米、小米：涞水县金谷粮油食品有限公司；苦荞米：成都大学-农业农村部杂粮加工重点实验室；甜酒曲：安琪酵母股份有限公司。

芦丁：苏州美仑生物科技有限公司；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐 [2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：上海麦克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：福州飞净生物科技有限公司；亚甲基蓝：天津市致远化学试剂有限公司；过硫酸钾：天津市科密欧化学试剂有限公司；酒石酸钾钠：福晨化学试剂有限公司；三氯化铝、没食子酸、无水碳酸钠：成都市科龙化工试剂厂。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50KBS）：上海申安医疗器械厂；智能型生化培养箱（SPX-250B）：上海琅玕实验设备有限公司；电子分析天平（ESJ210-4B）：龙腾电子有限公司；超声波清洗器（KQ-5200DE）：昆山市超声仪器有限公司；多功能酶标仪（Biotek Synerey HTX）：美国伯腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 操作要点

1）原料预处理：包括筛选、淘洗、浸泡、冲洗、沥干等步骤，将糯米、小米及苦荞米处理后备用。

2）蒸煮：锅上汽后加入原料进行蒸制，定时20min。

3）摊凉：将蒸煮后的原料摊凉，使温度降至25℃～30℃。

4）拌曲：分别加入酒曲和蒸馏水，进行混匀。

5）发酵：拌曲均匀后装入已编号的发酵瓶中，将压紧的原料中心掏窝封盖，置于28℃恒温培养箱中密封进行糖化发酵。

6）杀菌：将发酵好的产品密封于750mL发酵罐中，于75℃水浴中灭菌20 min。

1.3.3 小米苦荞米酒原粮配比及发酵工艺优化

1.3.3.1 原粮复配比的确定

固定总原粮质量200 g，以感官评分为指标，确定糯米、小米和苦荞3种原料的复配比。糯米配比的确定：设置糯米、小米、苦荞质量比分别为 4∶3∶3、5∶3∶3、6∶3∶3、7∶3∶3、8∶3∶3 进行单因素试验；小米配比的确定：设置糯米、小米、苦荞质量比为 6∶1∶3、6∶2∶3、6∶3∶3、6∶4∶3、6∶5∶3进行单因素试验；苦荞配比的确定：设置糯米、小米、苦荞质量比为 6∶3∶1、6∶3∶2、6∶3∶3、6∶3∶4、6∶3∶5 进行单因素试验，最后在单因素试验结果的基础上进行正交优化试验，以感官评分为指标，确定小米苦荞米酒的原粮复配比，因素及水平如表1所示。

表1 原粮复配比例正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test of raw grain mixture proportion

1.3.3.2 米酒发酵条件的确定

确定最佳原粮复配比之后，进行酒曲添加量、发酵时间、发酵温度的单因素及正交试验设计。称取总质量为200 g的糯米、小米、苦荞，比例为上述试验最佳配比。固定米酒发酵条件分别取浸泡时间3 h，蒸煮时间20 min，发酵温度28℃。选取各因素变量为米酒酒曲添加量（0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%）、发酵时间（48、72、96、120、144 h），以及料液比[20∶4、20∶5、20∶6、20∶7、20∶8（g/mL）]，在这 3 个关键工艺参数的单因素试验结果基础上进行正交优化试验，以感官评分为指标，确定小米苦荞米酒的发酵条件，因素及水平如表2所示。

表2 发酵条件正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test of fermentation conditions

1.3.4 品质分析

1.3.4.1 感官评定

根据NY/T 1885—2017《绿色食品米酒》要求进行感官评定，分别对米酒的色泽、风味、口感和组织状态进行评分。评分细则见表3。

表3 小米苦荞米酒感官评分细则Table 3 Sensory rating of millet Tartary buckwheat rice wine

1.3.4.2 理化指标、功能成分及微生物指标测定

小米苦荞米酒中还原糖、总酸、酒精度的检测分别参照 3，5-二硝基水杨酸法[20]、GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》[21]和GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》[22]。

参考张慧娟等[20]的试验方法进行产酒量的测定。挤压出的发酵完成的酒液体积，记为V酒液，用于发酵的原料质量记为m原料。产酒量按下式进行计算。

参考李为喜等[23]的试验方法，利用AlCl3分光光度法对样品总黄酮含量进行测定。精密称取破碎均质后的米酒样品2 g，用70%甲醇溶液定容至10 mL。于55℃、80 W条件下超声20 min后离心（8 000 r/min，15 min），取上清液用0.22 μm无菌滤膜过滤，于4℃冰箱冷藏备用。以芦丁质量浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到芦丁质量浓度与吸光度关系曲线的回归方程：Y=21.81X+0.095 1，R2=0.998 9。结合标准曲线及样品检测结果，分析计算样品总黄酮含量，以mg/g表示。

参考刘清等[24]的试验方法，稍做修改，利用Folin-Ciocalteu比色法对样品总酚含量进行测定。以没食子酸质量浓度（X）为横坐标，吸光度（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到没食子酸浓度与吸光度关系曲线的回归方程：Y=0.006 8X+0.002 4，R2=0.999 6。结合标准曲线及上述处理后的样品检测结果，分析计算样品总酚含量，以mg/g表示。

菌落总数、致病菌分别按照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》及GB 29921—2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》中规定的方法进行测定。

1.3.5 抗氧化活性分析

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的测定

样品用70%甲醇溶液配制成浓度为2、4、6、8、10 mg/mL的溶液。分别吸取2 mL样品溶液，加入2 mL DPPH溶液，摇匀后室温下遮光放置30 min使其反应完全，于517 nm测定吸光值为A1；分别另取2 mL样品溶液，加入2 mL 70%甲醇溶液，摇匀后室温下遮光放置30 min使其反应完全，于517 nm测定吸光值为A2；同时做空白试验，取2 mL 70%甲醇溶液，加入2 mL DPPH溶液，摇匀后室温下遮光放置30 min使其反应完全，于517 nm测定吸光值为A0[25]。按下列公式计算清除率。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除率的测定

ABTS储备液：准确称取过硫酸钾0.0155g于25mL棕色容量瓶中，用70%甲醇溶解后加入0.096 g ABTS，超声溶解后定容，摇匀避光保存于4℃冰箱冷藏12 h～16 h。使用时用70%甲醇稀释，得ABTS工作液，使其在734 nm波长下吸光值为0.70±0.02，现配现用。

分别吸取1 mL不同浓度的小米苦荞米酒供试液于试管中，再加入配制好的ABTS工作液2 mL，摇匀后避光静置30 min后于734 nm测定吸光值为A样品；同时做空白对照，吸取1 mL 70%甲醇溶液于试管中，再加入配制好的ABTS工作液2 mL，摇匀后避光静置30 min后于734 nm测定吸光值为A空白[26]。按下式进行计算。

1.4 数据处理与分析

采用Microsoft Office Excel 2019作图；采用IBM SPSS Statistics 21软件对所得的试验数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 原粮复配比的确定

2.1.1 糯米比例的确定

糯米作为制作米酒的一种重要原料，其添加量在不同程度上影响着米酒的感官评分。糯米添加比例对小米苦荞米酒感官评分的影响见图1。

图1 糯米添加比例对小米苦荞米酒感官评分的影响Fig.1 Effect of the proportion of glutinous rice on the sensory score of millet Tartary buckwheat rice wine

由图1可知，随着糯米添加比例的上升，感官评分呈现逐渐下降的趋势。当糯米、小米、苦荞质量比分别为 7∶3∶3 和 8∶3∶3 时，米酒整体风味较淡且口味不佳，色彩饱和度较低，导致米酒感官评分的总分较低；当糯米、小米、苦荞质量比分别为 4∶3∶3、5∶3∶3、6∶3∶3 时，制得的小米苦荞米酒颜色淡黄，质地均一有光泽，风味较好且感官评分较佳。因此原料复配中糯米、小米、苦荞质量比初步确定为 4∶3∶3、5∶3∶3 和 6∶3∶3，用于后续正交试验设计。

2.1.2 小米比例的确定

小米添加比例对小米苦荞米酒感官评分的影响见图2。

图2 小米添加比例对小米苦荞米酒感官评分的影响Fig.2 Effects of millet addition ratio on sensory rating of millet Tartary buckwheat rice wine

小米糯性强且风味较好，在制备米酒的过程中适当添加可增强米酒风味，但添加量过大则会造成米酒发黏、产生气泡，影响品质。由图2可以看出，当糯米、小米、苦荞质量比为 6∶1∶3、6∶2∶3、6∶3∶3 时米酒风味特征明显，易于大众接受；当糯米、小米、苦荞质量比为 6∶4∶3、6∶5∶3时米酒颜色过深且酒体浑浊、发酸发涩，造成评分降低。因此原料复配中糯米、小米、苦荞质量比初步确定为 6∶1∶3、6∶2∶3、6∶3∶3，用于后续正交试验设计。

2.1.3 苦荞比例的确定

苦荞添加比例对小米苦荞米酒感官评分的影响见图3。

图3 苦荞添加比例对小米苦荞米酒感官评分的影响Fig.3 Effect of Tartary buckwheat addition proportion on sensory score of millet Tartary buckwheat rice wine

苦荞通过发酵可改变小米苦荞米酒的理化特性、口感及滋味。由图3可知，随着苦荞添加比例的逐渐增加，成品米酒香气呈现先上升后下降的趋势。当糯米、小米、苦荞质量比为6∶3∶1时，成品米酒风味不佳，米酒中几乎无苦荞的特有香味；当糯米、小米、苦荞质量比为 6∶3∶2、6∶3∶3、6∶3∶4 时制备的小米苦荞米酒酒体醇厚，口感丰富，各类原料香味融合较好；但糯米、小米、苦荞质量比为6∶3∶5时，成品米酒颜色过浓、香味刺鼻、口感粗糙、苦荞特有的涩味过浓，造成综合感官评分低。因此原料复配中糯米、小米以及苦荞质量比初步确定为 6∶3∶2、6∶3∶3、6∶3∶4，用于后续正交试验设计。

2.1.4 原粮复配比正交优化结果分析

在单因素的试验基础上进行三因素三水平的正交试验。正交试验结果如表4所示，方差分析见表5。

表4 原粮复配比正交试验结果Table 4 Orthogonal test results of compound ratio of raw grain

表5 原粮复配比正交优化试验方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal optimization test of compound ratio of raw grain

由表4正交试验结果中极差R值可以看出，3个因素中对小米苦荞米酒感官评分影响主次顺序为C＞A＞B，即苦荞添加质量占比＞糯米添加质量占比＞小米添加质量占比。通过比较各因素试验指标平均值大小，可知3个因素的最优水平为A3B1C1，而表中感官评价结果最优为A3B3C1，分数为72.30。因此对A3B3C1、A3B1C1进行验证试验，结果得A3B1C1感官评分为69.60，最后确定小米苦荞米酒最佳原料配比为A3B3C1，即糯米、小米、苦荞质量比为 6∶3∶2。

由表5方差分析可知，3个因素中苦荞添加比例对综合感官评分影响显著，糯米及小米添加比例对结果影响不显著。方差分析结果和正交试验极差R值一致，苦荞添加比例是对感官评分影响最大的一个因素。

2.2 米酒发酵条件的确定

2.2.1 酒曲添加量的确定

酒曲添加量对小米苦荞米酒感官评分的影响见图4。

图4 酒曲添加量对小米苦荞米酒感官评分的影响Fig.4 Effects of yeast addition on the sensory score of millet Tartary buckwheat rice wine

酒曲中的微生物类型和数量对于发酵过程和发酵产物具有重要影响。当控制其他条件相同的情况下，酒曲添加量将影响米酒发酵进度，从而对成品米酒各项风味指标产生影响。由图4可知，随着酒曲添加量的增加，米酒原料中淀粉水解速度提高且酒精度较大，造成米酒出现发酸、产生气泡等情况，使得米酒的整体感官评分呈现先增加后下降的趋势。当酒曲添加量为0.3%时，米酒中微生物发酵缓慢，成品米酒甜度过高无酒精味；当酒曲添加量为0.7%时，米酒发酵过快，成品米酒无甜度但酒精味较重，口感粗糙。因此选择酒曲添加量0.4%、0.5%和0.6%进行后续正交试验。

2.2.2 发酵时间的确定

发酵时间对小米苦荞米酒感官评分的影响见图5。

图5 发酵时间对小米苦荞米酒感官评分的影响Fig.5 Effects of fermentation time on sensory score of millet Tartary buckwheat rice wine

米酒发酵时间对酒精度及可溶性固形物含量有明显影响，进而影响米酒的感官评分。由图5可知，随着发酵时间的延长，酒曲中的微生物逐渐开始生长繁殖，一段时间后开始无氧呼吸产生酒精，米酒的感官评分也呈现先增加后降低的趋势。在发酵前期，米酒中还原糖含量高且酒精含量偏低，甜味突出酒味较淡，成品米酒风味不足。发酵时间从96 h开始，酒味逐渐凸显，甜度适中。因此，选择发酵时间96、120、144 h进行后续正交试验设计。

2.2.3 料液比的确定

料液比对小米苦荞米酒感官评分的影响见图6。

图6 料液比对小米苦荞米酒感官评分的影响Fig.6 Effect of ratio of material to liquid on sensory score of millet Tartary buckwheat rice wine

料液比对米酒的发酵产生着较大影响。由图6可知，随着液体用量的增加，小米苦荞米酒的感官评分呈现先增加后减小的趋势。当料液比较高时，成品米酒甜味较淡、颜色浑浊、无光泽，酒精度偏高、产酒量过低且米酒出现发酸现象，综合感官评分较低；而料液比较低则会在发酵过程中影响微生物的生长繁殖，不利于酵母发酵，造成成品米酒酒精度较低且香气不正、滋味低劣，感官评分较低。因此选择料液比20∶6、20∶7（g/mL）和 20∶8（g/mL）进行后续正交试验。

2.2.4 发酵条件正交优化结果分析

以酒曲添加量、发酵时间及料液比为因素，进行三因素三水平的正交试验，结果如表6所示，方差分析见表7。

表6 发酵工艺正交试验结果Table 6 Orthogonal test results of fermentation process

表7 发酵工艺正交优化试验方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal optimization test of fermentation process

由表6正交试验结果中极差R值可以看出，3个因素中对小米苦荞米酒感官评分影响主次顺序为F＞E＞D，即料液比＞发酵时间＞酒曲添加量。通过比较各因素试验指标平均值大小，可知3个因素的最优水平为D1E2F1，而表中感官评价结果最优为D1E1F1，分数为79.60。因此分别对D1E2F1、D1E1F1进行重复验证试验，结果得D1E2F1感官评分为73.60，最后确定小米苦荞米酒最佳发酵条件为D1E1F1，即酒曲添加量为0.4%、发酵时间 96 h、料液比 20∶6（g/mL）。由表7可知，3 个因素中料液比对综合感官评分影响显著，酒曲添加量及发酵时间对结果影响不显著。方差分析结果和正交试验极差R值一致，料液比是对感官评分影响最大的一个因素。

2.3 米酒品质分析

2.3.1 感官指标

小米苦荞米酒外观均匀一致、澄清无杂质，呈现明亮淡黄色；酒香纯正无异味，带有小米及苦荞发酵后的特殊香味；风味柔和、口感细腻，酒体组分协调，可接受程度较高。

2.3.2 理化指标、功能成分及微生物指标分析

通过不同试验方法对小米苦荞米酒理化指标、功能成分以及微生物指标进行测定，结果如表8所示。

表8 小米苦荞米酒的理化指标及功能成分Table 8 Physical and chemical indexes and functional components of millet Tartary buckwheat rice wine

在发酵过程中，原料中的淀粉、糊精被微生物利用，水解生成糖类物质，再由酵母菌经无氧呼吸产生酒精。随着发酵时间的延长，米酒中的糖类化合物先增加后逐渐减少，当还原糖含量与酒精含量达到一定平衡时，米酒酒体丰厚，香气自然。由表8可知，经发酵工艺优化后得到的成品小米苦荞米酒酒精度为2.90%vol、还原糖含量达到9.92 g/100 g，同时含有总黄酮及总酚类功能活性成分，具有较高的营养价值。

2.3.3 米酒抗氧化活性分析

小米苦荞米酒对DPPH自由基及ABTS+自由基的清除率见图7。

图7 小米苦荞米酒对DPPH自由基及ABTS+自由基的清除率Fig.7 DPPH and ABTS+free radical scavenging activity of millet Tartary buckwheat rice wine

抗氧化能力可通过样品对DPPH自由基清除率表示，清除率越大，则抗氧化能力越强。如图7所示，在2 mg/mL～10 mg/mL时，小米苦荞米酒对DPPH自由基清除率与质量浓度的增加呈一定量效关系。当其质量浓度为2 mg/mL时，DPPH自由基清除率为37.18%；浓度为10 mg/mL时，清除率高达65.53%。进一步分析表明，该米酒对DPPH自由基的半数抑制浓度（IC50）为4.73 mg/mL，表明其具有较好的抗氧化活性。

ABTS+自由基清除能力模型被广泛运用于样品抗氧化活性的评价。在供试浓度（2 mg/mL～10 mg/mL）范围内，随着样品质量浓度的增大，其对ABTS+自由基的清除率呈现递增趋势。当供试浓度为10 mg/mL时，其对ABTS+自由基的清除率高达77.87%。小米苦荞米酒对ABTS+自由基的IC50值为6.07 mg/mL，表明该米酒具有一定的抗氧化能力。

3 结论

本研究选择糯米、小米以及苦荞作为米酒发酵的主要原料，以感官指标为评价依据，通过单因素及正交试验确定了小米苦荞米酒中糯米、小米和苦荞各原料的适宜质量比为6∶3∶2。进一步选用最佳原料质量比对发酵条件进行筛选优化，通过单因素及正交试验得到发酵的最佳工艺条件为酒曲添加量0.4%、发酵时间96 h、料液比 20∶6（g/mL）。最终所得的小米苦荞米酒外观质地均一，呈现淡黄绿色，芳香浓郁、清爽可口、风味独特、口感柔和，其酒精度、还原糖、总酸和微生物指标等均符合相应的标准。小米苦荞米酒在传统米酒基础上综合了小米以及苦荞的营养功能特点，既丰富了小米的精深加工产品类型，又在一定程度上有效解决了苦荞难加工、口感差的技术难点，从而有助于为新型复合型米酒的开发研制提供重要技术支撑。