纳米药物体外溶出测定方法研究进展

杨子毅，盛利娟，朱霖，林霞

(1.江南大学生命科学与健康工程学院，无锡 214000；2.江苏诺和必拓新药研发有限公司，无锡 214028)

随着医药科学的快速发展，纳米技术在临床被广泛用于肺部疾病[1]、皮肤病[2]、生殖医学[3]等各领域的诊断和治疗，纳米药物研究成为当今药物研究的热点之一。与传统药物递送系统相比，纳米药物具有众多优势[4-5]，如改善难溶性药物生物利用度、提高药物体内外稳定性、将药物靶向递送至人体病变组织部位、提高药物疗效等。

然而，近年来纳米药物存在的安全性风险被逐渐关注。质量评价对控制纳米药物安全性和有效性至关重要。其中体外药物溶出或释放是评价药物质量、监控药物制剂设计和批次间差异的关键质量属性[6]，是影响纳米药物生物利用度的基本特征之一，可在一定程度上反映纳米药物安全性、疗效和质量。此外，可以根据体外药物释放特征模拟纳米药物体内分布，如利用数学模型建立体内外相关性，预测纳米药物体内行为，加快纳米药物上市。笔者在本文综述不同类型纳米药物结构特点及现有溶出测定方法，以期为纳米药物开发提供参考。

1 纳米药物分类及释药特点

纳米药物主要包括药物纳米晶和载药纳米递送系统两类。纳米晶是将药物直接制备成具有纳米尺度的颗粒，并制备成供临床使用的适宜制剂；载药纳米递送系统是将药物以溶解、分散、吸附或包裹于适宜的载体或高分子材料中所形成的的纳米粒。其中载药纳米递送系统由于载体材料不同，制备工艺不同，其所形成的的纳米药物结构也不同，包括脂质体、聚合物胶束、纳米管、纳米囊/纳米球、纳米纤维、纳米乳、纳米凝胶等，结构示意图见图1[7]。目前已有几十种纳米药物应用于临床，部分已上市纳米药品及其结构类型见表1。

图1 部分载药纳米递送系统结构示意图[7]

表1 部分已上市纳米药品

由于纳米药物尺寸较小、结构复杂，与其他制剂相比，影响药物释放的因素更复杂。如纳米药物粒度分布、结构特点、载体材料自身降解特点、药物自身理化性质及与载体材料的相互作用、药物在制剂结构中的微观分布、纳米药物与体内蛋白之间的相互作用、纳米载体孔径大小、外部环境刺激、内部构象和渗透性等均可影响药物释放。不同纳米药物由于结构不同，影响药物释放的因素也有所区别。

1.1纳米晶 纳米晶也称为纳米混悬，其结构较简单，由纳米尺度的药物颗粒与吸附于粒子表面的稳定剂层组成。纳米晶经不同给药途径给药后，药物释放特点及影响因素也各不相同[8]。如经口服后，药物释放主要受药物理化性质、胃肠道分泌液环境影响。弱酸性药物在胃中溶解速率较低，进入肠道后，由于肠道pH值更高，溶解度显著增加。而弱碱性药物在胃中快速溶解，进入十二指肠后形成过饱和溶液体系。中性药物在胃肠道的溶出则主要依赖自身溶解速率和胃肠道分泌的增溶剂。此外，影响纳米晶释放的因素还包括物理稳定性(如聚结性和再分散性等)、与溶解和过饱和度相关的溶解性质、辅料对维持过饱和态的稳定作用等[9]。经静脉注射后，纳米晶体药物溶出速率主要与其在血液中的溶解速率相关。此外，进入体循环后也会被巨噬细胞吞噬，富集于肝脏和脾脏。纳米晶体经肌内注射后，可在注射部位诱发慢性肉芽肿炎症反应，给药24 h后，纳米晶体被炎症反应诱发的上皮样巨噬细胞包裹，在巨噬细胞内，药物缓慢溶解，达到缓释目的[10]。

1.2载药纳米递送系统

1.2.1脂质体 脂质体是内部为水相、由类脂质双分子层组成的超微囊载体制剂。脂溶性药物分散于脂质双分子层中，如维替泊芬和紫杉醇；或是与带有相反电荷的脂质形成复合物分散于脂质双分子层，如两性霉素B。亲水性药物通常以不同物理状态被包载于内水相，如顺铂和环丙沙星以过饱和溶液形式存在；长春瑞滨和长春新碱以无定型沉淀存在；多柔比星、柔红霉素和拓扑替康以纳米晶形式存在[11]。脂质体药物释放主要依赖药物渗透和扩散作用，其影响因素较复杂，包括脂质体本身理化性质、被包载药物的物理状态、以及外在因素如释放介质种类及是否含有渗透性离子、温度、pH值和酶等。影响脂质体药物溶出的理化性质包括药物在双分子层的渗透性、药物电离常数、药物与脂质双分子层的结合作用、药物自聚集性和脂质体内药物沉淀物的理化性质等。药物分子的尺寸和横截面积也显著影响药物在脂质双分子层的渗透和扩散。此外，内水相中缓冲盐浓度及类型、药物/脂质比例、内水相pH值、体积等对药物释放也有影响。

1.2.2纳米乳 纳米乳可以显著提高难溶性药物溶解度，已被广泛应用于难溶性药物静脉用注射剂及口服高效制剂的研究。其中药物可以溶解或分散于油相，也可以分布于界面膜。其药物释放影响因素包括药物与纳米乳界面乳化剂的结合作用、药物界面活性、乳滴粒径、脂质组成、界面膜稳定性、药物在纳米乳的微观分布。此外，纳米乳在体内环境中自身结构不稳定，易被机体代谢，也会加速药物释放。

1.2.3基于聚合物载体的纳米药物 基于聚合物载体的纳米药物结构类型包括聚合物胶束、纳米管、纳米囊、纳米球、纳米纤维以及纳米凝胶等。该类纳米药物的药物释放主要受以下因素影响：制剂组成(药物、聚合物类型和其他辅料)，各组分间比例，各组分间的相互作用，聚合物降解特性和制备工艺等。药物释放机制主要包括扩散、溶剂交换、聚合物降解和环境响应释放4类机制，具体见图2[12]。

图2 基于聚合物载体的纳米药物释药机制[12]

药物扩散控制释放在纳米囊和纳米球中较常见。纳米囊为“核-壳”结构，溶解或分散在核心的药物经溶解，并通过“壳”状结构扩散释放至体液或介质[13]。骨架型纳米球中药物通常分散于聚合物高分子材料基质，也存在扩散控制释放机制。

溶剂交换，即在药物释放过程中，溶剂进入某些纳米药物结构，从而影响纳米药物中药物释放，包括渗透压或溶胀控制释放。如纳米凝胶，其由具有三维网状结构的交联聚合物组成。纳米凝胶溶胀后，药物可经体系中溶剂通道溶解-扩散，释放至体液或介质。可以通过调整制剂中药物分布或聚合物类型，控制药物释放速度。如SHEN等[14]设计了一种具有氧化还原/超声波双重刺激反应的新型纳米凝胶系统，用于精确控制药物释放速度。

聚合物降解控制释放是以生物可降解高分子材料为载体的纳米药物中药物释放的重要释药机制之一。如聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]或聚己内酯(polycaprolactone，PCL)随着聚合物的降解，还会发生自催化降解，使骨架结构塌陷，水分进入制剂内部，药物释放。聚酸酐和聚原酸酯等通常发生溶蚀作用，并导致聚合物逐渐降解，药物释放。

环境响应型释药机制多应用于具有局部靶向治疗作用的纳米药物中，包括pH值、离子强度、超声、电化学或磁响应。其药物释放机制主要是纳米药物所处环境发生变化时，聚合物结构或溶解特性发生变化，制剂结构塌陷或瓦解，导致药物释放。

2 纳米药物的体外溶出测定方法

药物体外释放度是指药物在规定条件下从药物制剂中释放的速度和程度，是纳米药物的质量控制指标之一，一定程度上反映了纳米药物的体内行为，从而确保了药物临床使用有效性和安全性。它可指导制剂开发并可在一定程度上预测体内吸收特点。

纳米药物体外溶出/释放的主要测定方法包括取样分离法、透析法、流通池法等。在药物溶出/释放测定方法的研究中，无论是使用已有方法还是修订及重新建立方法，纳米药物的溶出/体外释放测定法均应经过充分验证，以确保方法的准确性和重现性[15]。

2.1取样分离法 取样分离法是将纳米药物直接分散于一定体积恒温释放介质，定时取样，取样后及时补充等量新鲜释放介质以维持相应漏槽条件，通过测定药物累积释放量评估药物释放行为。取出的样品可以使用过滤器分离释放介质和纳米药物，也可以采用离心分离法，如超速离心法和离心超滤法。取样分离法可以使用《中华人民共和国药典》标准溶出装置，包括桨法、篮法、小杯法等，也可以使用摇瓶法。

如ZHANG等[16]采用取样分离法，使用水浴恒温振荡器研究谷胱甘肽响应型姜黄素纳米胶束的体外释放，取样后采用超速离心法分离纳米药物和介质。该方法可以区分含有不同浓度谷胱甘肽浓度的介质，释放速率随谷胱甘肽浓度的增加而增加(图3)。美国食品药品管理局(FDA)溶出度数据库中，阿立哌唑缓释注射剂(Abilify Maintena®)以及两种帕潘立酮棕榈酸酯缓释注射液(Invega Sustenna®和Invega Trinza®)，均使用《美国药典》(United States Pharmacopoeia，USP)第二法桨法取样分离法测定体外释放度。

图3 谷胱甘肽响应型纳米胶束体外释放曲线[16]

取样分离法可以直接检测药物释放，并可以使用《中华人民共和国药典》规定的标准溶出设备开展，方法较简单。但该方法也存在一定局限性，如在释放过程中药物可能发生聚集；取样过程中由于纳米药物粒径较小，易堵塞或吸附在溶出装置的过滤系统中，取样时也有部分药物被取出，造成药物损失；以上因素均影响测定结果准确性。此外，在将样品中分散介质与纳米药物分离过程中，药物还在继续溶出，也影响结果的准确性。

2.2透析法 透析法是将纳米药物密封于含有释放介质的透析袋或者透析装置，再置于含有释放介质的容器，利用小分子可以通过半透膜，而纳米颗粒粒径大不能透过半透膜的特点，使游离药物扩散至释放介质。通过直接测定透析装置外侧释放介质中药物浓度，评估药物释放速度。也可以将纳米药物使用大体积释放介质稀释置于容器，将含有空白释放介质的透析袋或透析装置置于上述容器，测定透析袋内释放介质中药物浓度。透析法可以使用《中华人民共和国药典》标准溶出装置，包括桨法、篮法、小杯法、流通池法、扩散池法等，也可以使用简易方法如摇瓶法或烧杯搅拌法。

与取样分离法相比，透析法可以利用透析膜分离游离药物与纳米药物，在释放过程中可避免反复取样导致的药物损失，以及取样后繁琐的游离药物分离操作。目前，透析法已被广泛应用于纳米药物体外溶出研究中[17-18]。如NAIR等[17]使用透析法研究不同粒径(<50 nm，50～100 nm和>100 nm)苯妥英钠脂质体体外药物释放，随着粒径增大，体外释放速度显著降低，可以区分不同粒径脂质体的药物释放。

透析法中影响药物释放速度的重要因素是透析膜材质和截留分子量。透析膜材质主要有再生纤维素、纤维素酯和聚偏二氟乙烯[19]。需充分评估透析膜对药物的吸附作用，避免释放出的游离药物大量吸附于透析膜表面，进而影响游离药物向释放介质中扩散。此外，还需系统优化透析膜截留分子量，需在满足游离药物扩散通过的同时，避免纳米药物中小粒径颗粒通过或堵塞透析膜。

透析法虽然操作简单，但在实际应用中仍然存在一定问题。如纳米药物在透析袋或透析装置中聚集或沉降，透析袋或透析装置形状不固定导致释药表面积存在差异，在溶出装置中位置无法固定，难溶性药物易吸附于透析膜中，透析袋内可容纳的介质体积有限、往往难以达到漏槽条件等，这均导致无法测得纳米药物真实溶出速率。

透析膜对绝大多数药物扩散均产生一定屏障作用，从而减慢药物释放速度。因此，采用透析法测定的是表观药物释放动力学，是由真实药物释放动力学和药物在半透膜中的渗透动力学两者共同组成。JANAS等[20]设计了一种基于透析法的分散释放器(dispersion releaser)(图4)。该装置由样品供给室和外侧透析膜组成，供给室内装有搅拌桨。该装置可装载于USP第二法溶出装置(桨法)上，利用溶出仪搅拌动力，在供给室内对纳米药物进行搅拌，避免药物在透析装置内沉降聚结，促进药物扩散通过半透膜；并以氟比洛芬为模型药物，计算膜渗透常数，应用数学模型获得标准化药物释放曲线。

图4 分散释放装置图[20]

2.3流通池法 流通池法是指将释放介质以适宜的恒定流速流经样品适配器，与适配器内样品接触，释放介质经适配器上方过滤流出，在不同时间测定释放介质中药物浓度，计算释放度的方法。根据释放介质是否循环流经适配器，还分为开放式和循环式流通池法。该方法优势是，溶出装置为《中华人民共和国药典》标准溶出装置，样品位置以及样品与释放介质接触面积固定，释放过程中释放介质不断流经样品，可以维持适宜的漏槽条件，避免局部浓度差较低[21]。

YUAN等[22-23]使用流通池法结合透析装置，建立了多柔比星脂质体体外释放方法，通过优化介质中羟丙基-环糊精浓度、温度和待测样品浓度等参数，可以区分不同组成、不同理化性质和不同制备工艺所制备的多柔比星脂质体。TANG等[24]和LIU等[25]联合FDA相关研究人员建立了流通池法测定两性霉素B脂质体体外溶出，可以区分已上市两性霉素B脂质体原研产品(AmBisome®)及其仿制药，对产品质量控制以及仿制药开发具有重要指导意义。

2.4其他方法 MENEZES等[26]开发了一种传统桨法和超滤离心组合新方法，并与传统取样分离法、透析法进行比较，该组合方法更适合研究纳米颗粒制剂药物释放动力学。纳米药物的体外溶出测定方法还有电化学方法，该法是一种快速原位测量方法，可以实时监测药物释放，同时可以避免释放介质中未溶解药物引起的干扰[27]。但该技术仅适用于具有电化学活性的药物，其敏感性和响应性差异很大。除电化学方法外，非电化学法，如量热法[28]也可用于纳米药物体外溶出研究。CHI等[29]使用自制便携式分析仪测定3种非甾体抗炎药电纺丝的药物溶出。该方法可在线同步监测多种药物释放，且线性检测范围很宽，检测限(limit of detection，LOD)低至 μg·mL-1水平，为快速准确检测纳米纤维类制剂的溶出度提供了一种有前景的方法。

3 数学模型的建立及体内外相关性

药物释放机制和动力学是描述药物溶出的两个重要特征。药物在溶出介质中的溶解过程涉及不同物理现象，包括颗粒表面的润湿、固态作用力破坏、溶剂化、液体间扩散及周围液体对流现象等。利用数学模型可以更好地理解特定剂型的药物释放机制，利用计算机模拟技术获得的药物释放动力学可用于优化药物处方设计并减少药物制剂开发时间和成本。ROOS等[30]开发了一种新型纳米药物溶出数学模型，以预测药物在体内吸收机制。PONTRELLI等[31]通过数学模型参数反映pH敏感型载药纳米载体的释放，可用于表征药物动力学，从而优化纳米药物处方工艺。临床研究中，DOGRA等[32]利用数学模型研究纳米颗粒、肿瘤和个体相关参数确定纳米材料在肿瘤递送中的作用。JAFARI等[33]研究新型预合成磁性纳米复合聚氨酯基质的药物释放机制，并开发了一种合适的数学模型来预测体外乳腺癌治疗的定量靶向药物递送。

目前常用的数学模型包括零阶模型、一阶模型、Hixson-Crowell 模型立方根方程、Korsmeyer-Peppas 动力学方程和 Higuchi 模型等，通常使用多种数学模型组合提高预测准确性[33]。FAZLI-ABUKHEYLI等[34]在研究纳米多孔阳极氧化铝植入物改善局部药物递送的过程中提出了一种新的两阶段释药模型：第一阶段采用零级动力学模型，第二段采用一级动力学模型。将实验数据拟合到新模型中，实验数据与该模型预测数据相关性较好。

除体外溶出测定方法优化外，数学模型还可应用于纳米药物溶出的体内外相关性优化。体内外相关性(invitro-invivocorrelation，IVIVC)是指药物制剂的生物学性质与其物理化学性质(如体外释放度)之间建立的定量关系。通常将纳米药物体外溶出数据和血浆药物浓度时间曲线进行数学处理以建立相关性。IVIVC研究有助于加快药物处方筛选，为溶出测定方法的建立及生物等效性研究提供参考。然而建立具有良好IVIVC的纳米药物体外溶出测定方法仍具有较大挑战，药物的理化性质、制剂结构特点及生理环境均会对其产生影响[35]。SINGH等[36]使用混合计算机模拟模型预测替莫泊芬脂质体在人体中的药动学，建立了A级IVIVC。SARANGI等[37]在洛伐他汀固体脂质纳米粒的IVIVC研究中，通过优化数学模型，获得了良好的A级相关性，回归系数值为0.902。对已有数学模型进行分析和系统性优化，可以有效提高IVIVC的准确性。

4 总结与展望

体外溶出评价是控制纳米药物质量的重要手段，也是纳米药物处方工艺研究阶段的重要指标。纳米药物体外溶出测定往往存在许多挑战，如纳米药物粒径分布不均匀且结构复杂，体外溶出实验时取样分离不准确，过滤破坏纳米药物结构等。此外，纳米药物体内释放易受各种生理因素影响，例如体液量、血流速度、体内酶和蛋白、细胞作用等。因此建立具有良好体内体外相关性的体外溶出测定方法仍存在很大挑战。但随着纳米药物体外溶出测定方法研究的深入，包括溶出装置的改善、溶出介质的复杂性提升、数学模型及计算机辅助的介入，纳米药物的体外溶出测定方法开发日趋成熟。越来越多的方法显著改善了对纳米药物关键质量属性的区分力，为基于纳米药物的仿制药研发、创新制剂设计、纳米药物质量监管提供了有效帮助。