叶酸-人血白蛋白-索拉非尼纳米粒的制备与体外抗肿瘤活性评价*

高文慧，吴锦俊，简晓顺

(1.广州医科大学附属肿瘤医院药学部，广州 510095；2.广州中医药大学国际中医药转化医学研究所，广州 510006)

肝癌是我国第4位高发的恶性肿瘤和第2位肿瘤致死病因[1]，外科手术能延长早期患者生存期，是首选治疗方法。但肝癌早期检出率很低，很多患者确诊时已到中晚期，无法实施手术，全身治疗成为这些患者的最终选择。索拉非尼(sorafenib，SRF)是肝癌首选一线治疗药物，具有双重抗肿瘤作用：既可以阻断RAF/MEK/ERK通路抑制肿瘤增殖，也可以抑制血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)和血小板衍生生长因子受体(platelet derived growth factor receptor，PDGFR)，减少肿瘤血管生成。然而在临床实际应用中，索拉非尼无进展生存期仅为167 d，治疗效果并不理想。

纳米技术为改善抗肿瘤药物肿瘤靶向性和疗效提供了有效途径：将药物载入纳米材料，制备成纳米药物传递系统，已被证明能提高药物靶向性、抗肿瘤活性和全身用药安全性[2-3]。白蛋白是天然亲水性纳米材料，通过gp60受体和分泌型富含半胱氨酸的酸性蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC)在肿瘤部位特异性蓄积，对肿瘤具有天然亲和力，是理想的抗肿瘤药物载体[4-5]。

将肿瘤特异性配体连接到纳米药物传递系统表面，可进一步提高其肿瘤靶向性。研究表明，肝癌组织叶酸(folic acid，FA)受体表达率88.9%，其表达水平与已知高表达叶酸受体的Hela细胞相当[6]，因此叶酸是理想的肝肿瘤特异性靶向配体。FANSU等[7]制备的叶酸-牛血清白蛋白-黄芩苷纳米粒能显著提高黄芩苷对乳腺癌细胞体外和体内的抗肿瘤活性，说明叶酸修饰的白蛋白纳米粒能提高抗肿瘤药物对叶酸受体高表达肿瘤的靶向能力。

本研究采用叶酸修饰的白蛋白(folic acid-human serum albumin，FA-HSA)包载索拉非尼，制备叶酸-人血白蛋白-索拉非尼纳米粒(folic acid-human serum albumin-sorafenib nanoparticles，FA-HSA-SRF-NPs)，以提高索拉非尼对HepG2肝肿瘤细胞的靶向性和抗肿瘤活性，为该药的纳米剂型在肝癌治疗中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1药品与试剂 索拉非尼(中国阿拉丁公司，批号：1528035，含量≥99.9%)；1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐[1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC，上海麦克林生化科技有限公司]；(N)-N-二环己基碳二酰胺(N，N'-dicyclohexylcarbodiimide，DCC，上海麦克林生化科技有限公司)；N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxy succinimide，NHS，上海麦克林生化科技有限公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，Gibco公司)；人血清白蛋白(美国Sigma公司，批号：A0307A，含量≥96%)；叶酸(上海源叶生物科技有限公司，批号：JM0310RB14，含量≥96%)；无叶酸1640培养基(Gibco公司，批号：1968452)；胰蛋白酶(Gibco公司，批号：2046777)；二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，上海麦克林生化科技有限公司，批号：2540C551)；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(4'，6-diamidino-2-phenylindole dihydro-chloride，DAPI，上海麦克林生化科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒(Annexin V-FITC-PI apoptosis detection kit，联科生物科技股份有限公司，批号：A10714)；BCA蛋白测定试剂盒(BCA protein assay kit，赛默飞世尔科技公司，批号：UF281363)；苯甲基磺酰氟蛋白酶抑制剂(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF，大连美仑生物技术有限公司，批号：20171011，100 mmol·L-1)；聚(ADP-核糖)聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP，9542P-RabbitmAb，CST公司，批号：15)；β-tubulin(556321-MousemAb，BD公司，批号：8347561)；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF，Millipore公司)；增强型化学发光液(enhanced chemiluminescence，ECL，美国Bio-Rad公司，批号：102031360)。

1.2仪器与设备 HEPA Class 100二氧化碳(CO2)培养箱(德国Thermo电子公司)；5810R低温离心机(德国Eppendorf公司)；光学显微镜(德国Leica公司)；生物安全柜(Thermo电子公司)；多道可调移液器(Eppendorf 德国)；LC-20AT高效液相色谱仪(岛津公司)；1290超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；6460型三重四级杆质谱(美国Agilent公司)；超声波细胞粉碎仪(美国Branson公司)；ELX800多功能酶标仪(BioTek公司)；恒温水浴箱(德国Thermo Scientific公司)；FACSCanto II流式细胞仪(BD公司)；超纯水仪(美国Millipore公司)；液氮罐(德国Thermo Scientific公司)等。胶片(柯达公司)；6孔细胞培养板(美国Coming公司)；96孔细胞培养板(美国Coming公司)；超纯水；6孔细胞培养板(美国Coming公司)；细胞刮；盖玻片；流式细胞管等。

1.3细胞复苏与传代 HepG2细胞(广州医科大学肿瘤研究所赠)。37 ℃水浴融化冻存管，离心弃去上清液，完全培养基分散后继续培养。当瓶底细胞面积达80%～90%时弃去培养基，磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline，PBS)荡洗，胰酶消化，无菌吸管吹打分散细胞，离心，弃去上清液，用完全培养基分散，取50%重新培养。

1.4实验方法

1.4.1纳米粒的制备 ①人血白蛋白-索拉非尼纳米粒(HSA-SRF-NPs)：将索拉非尼10 mg溶于DMSO1 mL中，涡旋至完全溶解，逐滴加入人血白蛋白47.6 mL中(0.5%，超纯水)，搅拌30 min，加入EDC 3 mg交联2 h，PBS透析，每次12 h，共2次。

②叶酸活性酯(folic acid-N-hydroxysuccinimide，FA-NHS)：称取叶酸约300 mg、DCC约99 mg和NHS约78 mg，加入DMSO 10 mL中，搅拌使充分溶解，加入三乙胺溶液500 μL，避光反应过夜，过滤除去反应副产物，充分搅拌条件下逐滴加入冷丙酮/乙醚溶液中，过滤并真空干燥。

③叶酸-人血白蛋白：精密称取FA-NHS15 mg，加入DMSO 0.1 mL，涡旋至完全溶解。称取人血白蛋白0.119 g，加入pH 值9.6碳酸盐缓冲液20 mL，搅拌至完全溶解后加入上述FA-NHSDMSO溶液，避光反应1 h，超纯水透析24 h，每12 h换水一次。

④叶酸-人血白蛋白-索拉非尼纳米粒：精密称取索拉非尼5 mg，加入DMSO 0.25 mL，涡旋至完全溶解。将上述FA-HSA溶液稀释至23.8 mL(0.5%)，搅拌下加入索拉非尼的DMSO溶液，搅拌30 min后加入EDC3 mg，避光反应1 h，PBS透析24 h，每12 h换水一次。

1.4.2荧光标记HSA和FA-HSA制备 将FITC 10 mg用DMSO 1 mL溶解，配制成10 mg·mL-1储备液。

FITC-HSA的制备：称取白蛋白30 mg，用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer solution，CBS)5 mL溶解，加入FITC溶液(含FITC 0.5 mg)50 μL，避光反应过夜，PBS透析48 h，每12 h换透析液1次，直至外液澄清无颜色，4～8 ℃下避光保存。

FITC-FA-HSA的制备：称取白蛋白30 mg，CBS 5 mL溶解，加入FA-NHS 2 mg避光反应1 h后，加FITC溶液50 μL(含FITC 0.5 mg)，避光反应过夜，PBS透析48 h，每12 h换透析液一次，直至外液澄清无颜色，4～8 ℃下避光保存。

FITC溶液的配制：将FITC溶液50 μL(含FITC 0.5 mg)加入PBS7 mL中，混匀，4～8 ℃下避光保存。

1.4.3叶酸-人血白蛋白-索拉非尼纳米粒的表征 激光粒度分布和电位测定仪测定粒径分布和Zeta电位，透射电镜(transmission electron microscope，TEM)观察形态特征(3%磷钨酸染色，pH值7.0)。HPLC法测定载药量和包封率，超高效液相色谱串联质谱(ultra-high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UHPLC-MS/MS)系统测定叶酸偶联量。

1.4.4细胞对纳米材料的摄取

①共聚焦显微镜观察：6孔板中放置盖玻片，将HepG2细胞接种于盖玻片上，接种密度：每孔5×104个。培养24 h，分别加入FITC、FITC-HSA和FITC-FA-HSA100 μL，培养3 h。取出盖玻片，PBS清洗，室温下4%多聚甲醛固定30 min，超纯水洗3次，DAPI染色细胞核(蓝色)。将盖玻片正面朝下放在载玻片上，共聚焦显微镜上观察并摄影(×20)，每张图片用Image J软件测量荧光强度并计算平均吸光度。

②HepG2细胞内索拉非尼的含量测定：将HepG2细胞接种于6孔板，接种密度每孔5×105个，培养24 h，弃去上清液，加入含6 μmol·L-1索拉非尼、HSA-SRF-NPs或FA-HSA-SRF-NPs完全培养基，分别培养1，2，3 h后，PBS洗涤3次，吸干残留PBS，加入裂解液0.1 mL，4～8 ℃裂解30 min，再加入DMSO 0.05 mL，将裂解细胞刮入1.5 mL离心管，超声粉碎1～2 s，加入乙腈0.15 mL沉淀蛋白，涡旋混匀，12 000 r·min-1离心15 min (r=5 cm)，取上清液进样20 μL，HPLC法测定索拉非尼含量。

HPLC色谱条件。色谱柱：C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；检测温度：室温；流动相：乙腈和纯化水(70：30)，纯化水中含有三乙胺(20 mL/1000 mL)并用磷酸调节pH值至5.4；流速：1 mL·min-1；检测波长：265 nm；进样量：20 μL。

1.4.5细胞毒性评价 将HepG2细胞接种于96孔板，接种密度每孔5×103个，培养24 h，弃去上清液，依次加入含有索拉非尼、HSA-SRF-NPs或FA-HSA-SRF-NPS的完全培养基，使各孔索拉非尼的浓度分别为1.5，3，4.5，6，7.5，9 μmol·L-1，继续培养48 h。每孔加入MTT 10 μL，培养箱中孵化4 h，各孔加入DMSO 150 μL，震荡溶解10 min，酶标仪测定波长490 nm处吸光度值(A值)。根据公式：细胞存活率(%)=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%，计算分析样品的细胞毒性并进行比较(实验组：加药孔；对照组：未加药组；空白组：无细胞，只加培养液、MTT)。

1.4.6细胞凋亡检测 将HepG2细胞接种于6孔板，接种密度每孔1×105个，培养24 h，加入含13.5 μmol·L-1索拉非尼、HSA-SRF-NPs或FA-HSA-SRF-NPs的完全培养基，继续培养24 h。消化细胞，1×PBS洗涤3次。加入预冷1×binding buffer重悬细胞500 μL，分别加入Annexin V-FITC和PI5 μL染色，室温避光孵育5 min，混匀，上机，采用flowjo7.6版软件进行凋亡分析，计算细胞凋亡比例。

1.4.7凋亡相关蛋白的表达 将HepG2细胞接种于6孔板，接种密度每孔5×105个，培养24 h，不加药或分别加入13.5 μmol·L-1索拉非尼、HSA-SRF-NPs和FA-HSA-SRF-NPs，继续培养24 h，弃去培养基，每孔加入预冷PBS洗涤3次，加入细胞裂解液，收集裂解细胞并超声粉碎，离心取上清液，测定蛋白含量。将相当于蛋白含量40 μg的样品上样，60 V恒压电泳后进行转膜。采用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜，置于一抗孵育液PARP(1：1000)和β-tubulin(1：1000)中4 ℃过夜，二抗(1：5000)孵育2 h。配置ECL发光底物，化学发光并于暗室中显影、定影，检测目标条带。采用Image J软件测量Cl-PARP的Western blotting图中灰度值，将Cl-PARP灰度与β-tubulin相比进行归一化，计算相对蛋白表达量。

2 结果

2.1FA-HSA-SRF-NPs的表征 FA-HSA-SRF-NPs水合粒径为(85.4±3.3) nm(图1A)，多分散系数(polydispersity index，PDI)为0.154；Zeta电位为(-22.47±0.90) mV(图1B)，绝对值较高，稳定性较好(图1)。由图1 C可知，FA-HSA-SRF-NPs呈球形，大小约100 nm。最终测得纳米粒载药量和包封率分别为(3.83±0.26)%和(91.09±6.14)%，叶酸偶联量为(13.97±0.27) μg·mg HSA-1。

A.粒径；B.Zeta电位；C.TEM图像。

2.2细胞对纳米材料的摄取 共聚焦显微镜下FITC、FITC-HSA和FITC-FA-HSA在HepG2细胞内蓄积情况见图2。图中蓝色荧光为DAPI染色细胞核，绿色荧光为进入细胞质内FITC、FITC-HSA或FITC-FA-HSA。FITC仅可进入死细胞，活细胞内不会蓄积该荧光染料。由图2可知，FITC组HepG2细胞中未见荧光，FITC-HSA组仅少量HepG2细胞中有绿色荧光，FITC-FA-HSA组HepG2细胞中绿色荧光显著增加(F=419.555，P<0.05)。组间两两比较结果表明，FITC-FA-HSA组与其他两组均差异有统计学意义(P<0.01)，说明叶酸能促进白蛋白在HepG2细胞中的蓄积。

A.FITC组；B.FITC-HSA组；C.FITC-FA-HSA组；①与FITC组比较，P<0.01；②与FITC-HSA组比较，P<0.01。

2.3细胞对纳米粒的摄取 HPLC法测定索拉非尼、HSA-SRF-NPs和FA-HSA-SRF-NPs 3组HepG2细胞内索拉非尼含量，结果见图3。3组药物细胞摄取量均随时间延长而增加。加药1 h后，3组之间摄取量差异无统计学意义；加药2 h和3 h后，FA-HSA-SRF-NPs组HepG2细胞内索拉非尼含量显著增加(F2 h=11.287，F3 h=25.916，P<0.05)，组间两两比较结果表明，FA-HSA-SRF-NPs组与其他两组间均差异有统计学意义(P<0.05和P<0.01)，证明嫁接叶酸能提高HepG2细胞对FA-HSA-SRF-NPs的摄取。

①与索拉非尼组比较，P<0.05；②与HSA-SRF-NPs组比较，P<0.01；③与索拉非尼组比较，P<0.01。

2.4细胞毒性实验 不同浓度索拉非尼、HSA-SRF-NPs与FA-HSA-SRF-NPs对HepG2细胞存活率的影响见图4。由图4可知，索拉非尼组与HSA-SRF-NPs组细胞存活率差异无统计学意义，甚至加药浓度为9 μmol·L-1时，HSA-SRF-NPs体外细胞毒性显著低于索拉非尼(P<0.01)。随着药物浓度增加，FA-HSA-SRF-NPs组细胞存活率显著降低(F6 μmol·L-1=7.463，F7.5 μmol·L-1=9.880，F9 μmol·L-1=26.531，P<0.05)，组间两两比较结果表明，FA-HSA-SRF-NPs组细胞的存活率显著低于其他两组(P<0.05)，说明叶酸修饰能增强索拉非尼的抗肿瘤活性。索拉非尼、HSA-SRF-NPs和FA-HSA-SRF-NPs对HepG2细胞IC50分别为6.83，8.09和5.78 μmol·L-1。

①与索拉非尼组比较，P<0.05；②与HSA-SRF-NPs组比较，P<0.05；③与HSA-SRF-NPs组比较，P<0.01；④与索拉非尼组比较，P<0.01；⑤与HSA-SRF-NPs组比较，P<0.01。

2.5细胞凋亡实验 索拉非尼、HSA-SRF-NPs与FA-HSA-SRF-NPs对HepG2细胞凋亡的影响见图5。由图5可知，对照组、索拉非尼组、HSA-SRF-NPs组与FA-HSA-SRF-NPs组凋亡细胞率分别为6.5%，21.8%，16.4%和33.1%(包括早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞)。FA-HSA-SRF-NPs对HepG2细胞具有显著的促凋亡作用(F=24.727，P<0.05)，组间两两比较结果表明，FA-HSA-SRF-NPs组凋亡细胞百分比显著高于其他两给药组(P<0.01)。

A.不加药物以及分别加入索拉非尼、HSA-SRF-NPs和FA-HSA-SRF-NPs培养24 h后各组细胞凋亡图；B.3给药组细胞凋亡百分比柱状图；a.索拉非尼组；b.HSA-SRF-NPs组；c.FA-HSA-SRF-NPs组。

2.6凋亡相关蛋白的表达 图6为HepG2细胞未处理以及用索拉非尼、HSA-SRF-NPs和FA-HSA-SRF-NPs处理后，各组PARP/Cl-PARP的Western blotting图和Cl-PARP相对表达量图。由图6可知，FA-HSA-SRF-NPs组Cl-PARP蛋白表达量显著增加(F=796.876，P<0.05)，Cl-PARP在各组间表达量均差异有统计学意义(P<0.01)，表达量由高到低依次为：FA-HSA-SRF-NPs>索拉非尼>HSA-SRF-NPs>对照组。

A.对照组；b.索拉非尼组；c.HSA-SRF-NPs组；d.FA-HSA-SRF-NPs组；①与对照组比较，P<0.01；②与索拉非尼组比较，P<0.01。

3 讨论

笔者在本研究采用化学交联法成功制备叶酸修饰的人血白蛋白索拉非尼纳米粒。通常情况下，叶酸嫁接是通过FA-NHS与白蛋白纳米粒表面的活性氨基反应，共价结合到纳米粒表面。实际制备过程中发现，该反应的发生需要碱性条件，但溶液pH值升高会使索拉非尼从白蛋白纳米粒中析出，导致制剂不稳定，降低索拉非尼载药量和包封率，并且仅有少量叶酸嫁接到白蛋白表面，影响纳米粒主动靶向能力。通过查阅文献[8]，笔者改变制备步骤：先在碱性条件下将叶酸嫁接到白蛋白上，再在pH值7的溶液中用FA-HSA包载索拉非尼。该方法制备的FA-HSA-SRF-NPs水合粒径(85.4±3.3) nm，Zeta电位(-22.47±0.90) mV，稳定性较好；载药量与包封率分别为(3.83±0.26)%和(91.09±6.14)%，包封率显著高于同类研究[9]；叶酸嫁接量达(13.97±0.27) μg·mgHSA-1，与目前文献报道的嫁接量相近[10]。

细胞水平研究发现，FA-HSA-SRF-NPs在HepG2细胞中的摄取、细胞毒性和促凋亡能力均显著优于索拉非尼。共聚焦显微镜观察实验中，FITC-HSA荧光密度与FITC相比差异无统计学意义。ZHANG等[11]制备聚合物共载索拉非尼和多柔比星纳米粒，其表面用PEG修饰以增加亲水性，发现其在HepG2细胞中的吞噬量与溶液剂相比差异无统计学意义。推测HepG2细胞可能对白蛋白亲和力较弱，因此HSA-SRF-NPS并未增加索拉非尼进入HepG2细胞的量。然而，嫁接叶酸后无论是FITC-FA-HSA还是FA-HSA-SRF-NPs，进入HepG2细胞的量均显著提高，抗肿瘤活性显著增加，说明嫁接叶酸能促进HepG2细胞对白蛋白纳米粒的摄取，这可能与叶酸受体介导的内吞作用有关：更多纳米粒被转运入HepG2细胞中，提高了抗肿瘤活性[12]。

然而，FA-HSA-SRF-NPs的抗肿瘤活性仍可进一步提高：FA-HSA-SRF-NPs粒径小，表面又有很多活性基团，因此可在其表面继续连接其他抗肝肿瘤药物或肝肿瘤特异性配体等[13]。未来笔者也将继续改进该纳米制剂，同时在整体动物水平评价其抗肿瘤活性，为其向临床转化提供理论基础。