坏死性凋亡在脓毒症中的研究进展

刘晓珺， 张 航， 宋娟娟， 吕信鹏， 杜雅菊， 邓 颖

脓毒症是机体对感染反应失衡而导致的危及生命的器官功能障碍。尽管脓毒症发病机制的研究已取得重大进展，但紊乱的细胞信号转导机制、难以控制的炎症级联反应以及导致机体严重障碍的能量代谢、免疫反应，使得其治疗相对困难，因此，脓毒症仍然是导致全球患者死亡的主要原因，也是重症监护室和急诊科医生最关注的急性综合征之一[1]。细胞死亡可以在生长、发育、稳态、炎症、免疫和各种病理生理过程中发挥极其重要的作用。坏死性凋亡(necroptosis)是一种新兴的程序性细胞死亡形式，是对环境压力的细胞反应，可由化学和机械损伤、炎症等引起，具有与坏死相同的形态学变化，包括质膜完整性丧失、细胞质的透明化、细胞体积增加、细胞器肿胀、核脱氧核糖核酸(DNA)的聚集和降解等，但这种坏死又是可以调控的。越来越多证据[2]表明，坏死性凋亡是重要的细胞死亡形式，在病理生理学方面的作用备受重视，许多疾病被认为与其相关，如脓毒症、神经退行性疾病和缺血再灌注损伤等。本综述旨在探讨坏死性凋亡在脓毒症中的研究进展。

1 坏死性凋亡

长期以来，有学者将细胞死亡归属为细胞凋亡和坏死两种形式。20世纪80年代末，第一次揭示坏死可能也依赖于基因编码机制[3]。2003年，Chan等[4]描述了一种受体相互作用蛋白激酶(RIP)介导的细胞死亡形式，与细胞凋亡不同，其依赖于肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor， TNFR)、肿瘤坏死因子相关的细胞凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)和Fas。2005年，Degterev等[5]首次发现坏死素抑制剂(necrostatin-1, Nec-1)，是受体相互作用蛋白激酶-1(receptorinteracting protein kinase 1,RIP1；也被称作RIPK1)的抑制剂，有力证实了这种坏死的可控性。2009年坏死性凋亡取得里程碑式的进展，确立了RIP1-RIP3在坏死性凋亡中的作用[6]。2012年，细胞死亡命名委员会(nomenclature committee on cell death, NCCD)建议将 “necroptosis”作为这种新型细胞死亡(调节性坏死)的一个特殊术语[7]。2018年，NCCD提议将“necroptosis”定义为主要是依赖于混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase-like， MLKL)、RIPK3和RIPK1激酶活性的细胞外或细胞内稳态扰动引起的调节性细胞死亡[8]。

1.1坏死性凋亡的分子机制

RIPK1是坏死性凋亡途径中第一个被识别的信号分子，但RIPK1是一种多功能信号激酶，可以触发核转录因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein, MAP)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-8介导细胞凋亡等的激活，因此，RIPK1并不能准确用作坏死性凋亡激活的标记[9]。最近有研究[10]发现，RIPK3是决定细胞死于凋亡或坏死的分子开关，而不是RIPK1。RIPK1在缺乏RIPK3的情况下会驱动细胞凋亡，只有在RIPK3明显表达的情况下才会触发坏死。实验[11]证明，RIP3(RIPK3)及其底物MLKL在坏死性凋亡中发挥专门的作用，这一调控途径更加明确。

RIPK1是一种多结构域丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包括N端激酶结构域、中间结构域、RIP同型作用(RHIM)结构域及包含6个α螺旋的C端死亡结构域(DD)。RIPK1结构域具有不同功能，即N末端调控激活NF-κB信号途径，使细胞存活；RHIM则与RIPK3形成坏死小体参与调节程序性坏死；C末端结构域招募TNFRl而诱导凋亡。RIPK1启动生存或死亡的不同途径，由其泛素化、磷酸化和裂解状态等决定。

坏死性凋亡是由广泛的信号通路网络诱导的，如肿瘤坏死因子(TNF)-α、FasL和TRAIL、干扰素(interferons, IFNs)[12]、Toll 样受体(toll-like receptors, TLRs)[13]及病毒介导的途径等。目前，对 TNF-α介导的坏死性凋亡研究最为详细[10]。TNF-α可与TNFR1或TNFR2两个受体之一结合。若 TNF-α与受体TNFR1相结合，在胞内募集RIPK1、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)、细胞凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins， cIAPs)和转化生长因子-β活化激酶-1(transforming growth factor-β-activated kinase-1, TAK-1)等信号分子聚集，并在胞膜上形成膜状复合物Ⅰ[14]。cIAP1和cIAP2都是E3连接酶，引起复合物Ⅰ中蛋白质的多泛素化，RIPK1可作为连接信号分子的平台(即IKK复合物)，进而激活NF-κB等炎症途径。随后，复合物Ⅰ的修饰和内化使TNFR-1与复合物Ⅰ分离，释放的RIPK1与caspase-8和Fas 相关死亡结构域蛋白(fas-associating death domain-containing protein， FADD)结合，形成细胞质复合物Ⅱ[15]。当 caspase-8被激活时，通过蛋白水解作用抑制RIPK1和RIPK3活性，形成复合物Ⅱa，诱导细胞发生凋亡；当 caspase-8 被抑制或其活性水平相对较低时，RIPK1和RIPK3不会被裂解，而是促进 RIPK1去泛素化，与RIPK3、FADD结合，并通过RHIM募集MLKL形成复合物Ⅱb，又称为坏死体(necrosome)。体外实验证明，坏死性凋亡严格依赖RIPK3激酶的活性，Ripk3-/-细胞和RIPK3抑制剂能明显抑制坏死的发生。MLKL是激活RIPK3激酶依赖性坏死的门户，MLKL的T357和S358位点磷酸化被激活，引起寡聚化和质膜易位。寡聚化的MLKL与磷脂酰肌醇磷酸酯结合，导致细胞膜破裂；质膜易位使钙和钠通量改变，膜通透性增加，离子内流，细胞内渗透压升高，进而发生细胞死亡[16]。MLKL首先是在人类结肠腺癌HT-29细胞模型中被确认。MLKL基因进行选择性剪接后产生两种亚型，具有激酶结构域的较长剪接变异体导致TNF诱导的坏死。据文献[17-18]报道，如果磷酸盐结合P环缺陷，与对激酶活性所必需的关键氨基酸置换，MLKL将失去内在激酶活性。RIPK3下游的其他效应因子还包括丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(serine/threonine-protein phosphatase)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶-Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase, CaMK-Ⅱ)、磷酸甘油酸变位酶5(phosphoglycerate mutase 5, PGAM5)、动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1, Drp1)等。

1.2坏死性凋亡的病理生理学意义 坏死导致损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)释放，如炎症反应的激活剂和调节剂白细胞介素(IL)-1α、IL-β、IL-33、高迁移率族蛋白1(HMGB1)等，这些因子的释放促进Toll样受体(toll-like receptors, TLR)、RIG-I样受体(RIG-I-like receptors, RLRs)和C型凝集素受体(C-type lectin recepto, CLRs)的激活，进一步诱导炎症反应，以对抗和消除病原体。在免疫系统中，坏死性凋亡可以在T细胞发育过程中调节外周组织T细胞数量。对RIPK3/caspase-8和RIPK3/FADD双敲除小鼠的研究[19]表明，RIPK3介导的坏死对于在发育过程中清除异常淋巴细胞是必须的。坏死的诱导可能还会促进肿瘤细胞的死亡和清除[20]。坏死性凋亡与坏死有类似的病理作用，如活性氧(ROS)的产生、线粒体膜超极化、溶酶体膜及细胞膜通透性增加等[21-23]。

2 坏死性凋亡在脓毒症中的作用

越来越多实验证实，坏死性凋亡可以导致机体各器官的急性或慢性损伤。坏死性凋亡被认为是新生儿缺氧缺血(hypoxia-ischemia, HI)脑损伤、创伤性脑损害、缺血及出血性脑卒中、肌萎缩性侧索硬化症以及神经变性疾病的重要机制[24-30]。而在肺部相关疾病，如肺感染、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、急性肺损伤及肺癌中也有报道[31-32]。实验[33-34]证明，Nec-1能够减弱顺铂诱导的急性肾损伤(AKI)小鼠模型中肾形态的恶化，同样对缺血再灌注导致的AKI也有保护作用。在急性心肌梗死、心脏缺血再灌注损伤、心脏移植、炎症性肠病、肠道肿瘤、酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、病毒性肝炎、药物性肝损伤、急性胰腺炎等疾病中，有广泛实验支持坏死性凋亡发挥了重要作用[35-41]。

2.1感染性疾病与坏死性凋亡 在感染性疾病发展过程中，致病微生物通过分泌各种毒力因子引起宿主感染或发生免疫逃离。坏死性凋亡已成为微生物感染中关键的细胞死亡反应。一方面，细胞通过该途径消除病原体来增强自卫；另一方面，坏死有助于细菌在宿主中传播或增殖。大量细胞内容物的释放会加剧周围组织损伤，这与疾病的严重程度密切相关。因此，利用坏死性凋亡可调节性的特点，能够有效缓解病原体对机体的损害和改善症状[42]。

2.1.1 病毒感染与坏死性凋亡 研究发现，痘病毒对caspase-8活性的抑制，可以为坏死性凋亡提供自然的启动信号。缺乏RIPK1或RIPK3感染的牛痘病毒(vaccinia virus, VV)细胞，抑制了TNF诱导的坏死性凋亡的发生，Ripk3-/-小鼠和突变体无RIPK1激酶活性的D138N小鼠，都无法控制体内的VV复制[6]。E3L是VV编码的免疫调节剂之一，它包含一个z-DNA结合域，而在哺乳动物RIPK3的受体同源相互作用蛋白结构域(RHIM)适配器中发现，有z-DNA结合蛋白1(z-DNA binding protein 1, ZBP1)的存在。E3L缺失的VV感染，导致ZBP1表达增加及IFN诱导的RIPK3/MLKL依赖性坏死的发生[43]。Ripk3-/-小鼠表现出对单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)的高度敏感性，因为HSV-1可以编码和表达含有RHIM的ICP6蛋白，该蛋白直接与RIPK3结合，以激活坏死性凋亡。有研究[44]表明，ICP6缺失HSV-1，能够在高剂量HSV-1长期感染后诱导RIPK3依赖性坏死。研究显示，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus, RSV)诱导的支气管上皮细胞死亡与磷酸化的RIPK1和MLKL增加有关， RIPK1或MLKL的抑制，减弱了RSV的迁移和复制，降低了病毒载量[45]。甲型流感病毒(influenza a viruses, IAV)是坏死性凋亡的有效激活因子，ZBP1作为IAV感染的宿主蛋白，能够激活RIPK3，并启动细胞死亡信号。ZBP1-RIPK3细胞死亡信号系统是宿主防御IAV感染的重要途径，野生型小鼠限制了IAV在感染肺部的传播，并最终可以在感染10天内从肺组织清除，但Zbp1-/-或Ripk3-/-小鼠都不能抑制病毒的传播，Zbp1-/-和Ripk3-/-小鼠中被感染的肺细胞成为了病毒的工厂，由于死亡信号受损的细胞不能阻止病毒复制，并迅速传播到周围未被感染的细胞，肺泡细胞广泛受损，气体交换障碍，最终导致呼吸衰竭。同时，Ripk3-/-小鼠的T细胞对受感染肺的浸润也明显减少，IAV特异性CD8细胞毒性T淋巴细胞(CTL)数在这些小鼠的肺部明显减少，并且CTL不能像野生型小鼠那样具有有效的功能[46-47]。在IAV感染期间，坏死样凋亡也有不利的一面，表现为细胞坏死裂解，释放大量炎症介质，包括DNA本身，释放到细胞外环境中，作为免疫细胞的信号，加重组织损伤，相比之下细胞凋亡是细胞的有序分解，形成的凋亡体可以有效的免疫沉默。小鼠特异性巨细胞病毒(mouse-specific murine cytomegalovirus, MCMV)已被证明与依赖于RHIMs的级联相互作用的坏死性凋亡相关联。MCMV表达M45蛋白，包含一个RHIM序列的N端无催化活性的核糖核苷酸还原酶结构域，该病毒RHIM序列的存在，可以抑制坏死性凋亡途径[48]。寨卡病毒 (zika virus, ZIKV) 为一种蚊媒病毒，能感染人类并导致神经系统损害。于ZIKV感染的星形胶质细胞中检测到磷酸化的RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白表达增加，而RIPK3抑制剂GSK′872 预处理后，细胞死亡受到抑制，病毒复制明显增加，这证明坏死性凋亡可能对星形胶质细胞中病毒复制具有保护作用，而用Nec-1抑制RIPK1没有效果，这表明，ZIKV诱导的星形胶质细胞坏死性凋亡不依赖于RIPK1[49]。关于登革热病毒(dengue virus, DENV)、肠道病毒、严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV-2)、新型冠状病毒肺炎(COVID-19)、禽流感病毒(H7N9)等感染的研究，都有坏死性凋亡参与发病的报道[50-52]。

2.1.2 细菌感染与坏死性凋亡 坏死性凋亡是细菌感染过程中诱发的较为关键的细胞死亡途径。肠道病原性大肠杆菌(enteropathogenic escherichia coli, EPEC)可以合成和分泌大量免疫原性效应蛋白NleB1，它通过修饰FADD的精氨酸残基和RIPK1死亡结构域来阻止细胞坏死，NleB1-/-防御性的EPEC无法于肠上皮细胞中繁殖，表明细菌诱导的坏死对生物体具有保护机制[53]。RIPK3的缺失导致宿主细胞对叶尔森氏菌敏感性增加，如果FADD或caspase-8同时被敲除，这些细胞对叶尔森氏菌可能会变得更加敏感[54]。在体外，鼠伤寒沙门氏菌导致感染的巨噬细胞发生RIPK1和RIPK3依赖的程序性细胞死亡，RIPK3敲除可明显降低脾脏巨噬细胞的死亡，减少细菌数量，延长小鼠生存时间。此外，沙门氏菌还可以通过靶向RIPK1/3诱导微小RNA(miR)-155，增强巨噬细胞的坏死性凋亡[55]。成孔毒素(pore-forming toxin, PFT)是各种致病细菌中最常见的毒力因子，可引起细胞及细胞器膜通透性改变、离子稳态失衡、三磷酸腺苷(ATP)及ROS的产生与代谢障碍。有学者[56]报道，黏质沙雷菌、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、单核细胞性李斯特菌(listeria monocytogenes)、尿致病性大肠杆菌(uropathogenic escherichia coli, UPEC)和纯化重组气溶菌(purified recombinant pneumolysin)等产生PFT的细菌病原体，均能诱导巨噬细胞坏死，用RIP1、RIP3和MLKL抑制剂干预，起到预防巨噬细胞死亡的作用。金黄色葡萄球菌USA300菌株能引起严重肺炎，该菌株的毒力归因于它表达了多种毒素，包括解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)、Nod样受体蛋白3(NLRP3)和白细胞分化抗原11b(CD11b)，实验研究显示，RIPK1/RIPK3/MLKL信号诱导的坏死性凋亡与金黄色葡萄球菌毒素产生高度相关，抑制RIPK10或MLKL，能减轻细胞毒性。MLKL抑制阻断了caspase-1和IL-1β的产生，Rip3-/-小鼠的金黄色葡萄球菌清除率明显改善，并且IL-6、TNF、IL-1α和IL-1β明显降低，减少了炎症反应[57]。基因表达分析显示，RIPK3不仅在免疫细胞中大量表达，胃肠道尤其是小肠中也有大量表达。研究显示，给Ripk3-/-小鼠口服单核细胞性李斯特菌后，可引起其有效传播，并发全身感染，而在野生型小鼠中几乎没有观察到传播。令人惊讶的是，李斯特菌感染激活了RIPK3-MLKL通路，并未导致宿主细胞死亡，而是直接抑制了李斯特菌在细胞内复制[58]。结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)感染后，TNF-α的过度释放会导致RIPK1/RIPK3/MLKL依赖性坏死信号通路的激活，产生大量ROS，以消除和控制巨噬细胞内MTB的生长和繁殖。但当细胞中坏死时，又导致细胞释放细菌，因此，如何控制细胞内细菌的生长，防止被感染巨噬细胞的死亡和细胞外细菌的传播，是控制MTB感染的关键[59]。

2.2脓毒症与坏死性凋亡

2.2.1 肝损伤与坏死性凋亡 研究表明，坏死性凋亡在脓毒症中起关键作用。RIPK1激酶活性缺陷的D138N/D138N小鼠，在全身炎症反应综合征(SIRS)中表现为对TNF或TNF/zVAD诱导的不敏感。有实验证明，miR-425-5p作用于RIPK1，以降低RIPK1/RIPK3信号通路和炎症反应，miR-425-5p的下调加重了脂多糖(LPS)诱导小鼠的肝损伤，但miR-425-5p的过表达则通过RIPK1抑制，对LPS诱导的坏死性凋亡和炎症反应有保护作用。因此，有学者[60]提出，miR-425-5p/RIPK1轴能够抑制坏死途径，以保护脓毒症小鼠的肝损伤。还有学者通过LPS诱发脓毒症仔猪模型，并用Nec-1进行干预，观察肝损伤中坏死性凋亡的情况，结果发现，无Nec-1干预组肝脏中坏死凋亡关键成分RIPK1、RIPK3和MLKL，线粒体蛋白PGAM5和DRP1，及细胞内损伤相关分子模式HMGB1，以时间依赖性方式增加，反映肝脏炎症、形态损害和功能障碍的指标IL-1β、IL-6和TNF-α表达增多，血清谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(AKP)活性升高。 Nec-1预处理后可明显降低RIP1、RIP3、MLKL、PGAM5、DRP1和HMGB1的表达，明显减轻肝脏炎症和损害。因此得出结论，坏死性凋亡与脓毒症肝损伤的发病机制有关，抑制坏死性凋亡途径可能起到保护作用[61]。也有相反的报道，有学者在盲肠结扎脓毒症大鼠模型肝脏组织中同样观察到坏死性凋亡的存在，RIPK1、RIPK3 和MLKL随着时间的增加而高表达，但在肺和肾组织中没有发现RIPK1、RIPK3 和MLKL的高表达。 经Nec-1预处理后，肝脏组织各时间点RIPK1、RIPK3 及 MLKL的表达相应降低，抑制了坏死性凋亡。但有趣的是，该模型中大鼠的生存时间却缩短，并导致肝功能和组织病理学进一步恶化。此外，发现B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(Bax)/B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)比值增加，促进细胞色素C释放，导致促凋亡分子caspase-3激活，caspase-8、caspase-9蛋白表达增加，从而加速了肝细胞凋亡。因此，作者推测坏死性凋亡对脓毒症大鼠肝脏起到保护作用，其原因是坏死性凋亡阻断了信号级联反应的扩增，减轻细胞凋亡[62]。

2.2.2 心肌损伤与坏死性凋亡 许多脓毒症患者内皮屏障功能受损。有研究表明，增强血管内皮细胞稳定性和调节其对促炎细胞因子水平的反应，能明显提高小鼠存活率。实验[63]证明，经TNF处理的Ripk1D138N / D138N小鼠的肠道或血管通透性没有明显增加，也没有激活凝血级联反应，但却减少了内皮细胞坏死性凋亡的发生，从而为脓毒症患者提供临床益处。心脏功能障碍是脓毒症主要死亡原因之一。研究[64]发现，脓毒症大鼠心肌组织中过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-γ)的激活，降低了RIPK1、RIPK3和MLKL在心肌组织中的表达，减少促炎因子生成，从而减轻心脏炎症，抑制坏死性凋亡，防止心肌功能障碍的发生、发展。

2.2.3 肺损伤与坏死性凋亡 在盲肠结扎诱导的脓毒症小鼠幼崽模型中，血清IL-6、IL-1β 和IL-18 水平明显增加，肺脏中IL-6、IL-1β、IL-18 mRNA水平亦增多，使用Nec-1处理后，这些炎症因子及肺脏中mRNA的表达均下降，明显改善了脓毒症幼崽的肺组织学损伤评分，并将7天存活率从0升高至29%[65]。

2.2.4 肠损伤与坏死性凋亡 在LPS诱导的脓毒症猪模型中，观察到空肠细胞出现典型的坏死性凋亡，RIPK1、RIPK3、MLKL、PGAM5和HMGB1表达增加，血清及空肠炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6增多，同时伴有空肠形态的损害，以及消化和屏障功能降低。Nec-1可以抑制坏死性凋亡，RIPK1、RIPK3、MLKL、PGAM5、HMGB1蛋白表达下降，减少空肠形态损伤，并改善消化和屏障功能，同时还降低血清和空肠促炎细胞因子水平，以及空肠巨噬细胞和单核细胞数量。因此，Nec-1可能对脓毒症肠损伤有预防作用[66]。

3 总结与展望

坏死性凋亡是近年来新发现的一种细胞死亡形式，在生理条件下，坏死性凋亡是体内一种正常的程序性细胞死亡事件，通过基因调控，实施自杀保护措施，不仅能促进细胞的正常代谢，还能参与维持体内稳态，清除体内非必要或病理细胞，以消除潜在的疾病危害。然而，在脓毒症发病过程中，坏死性凋亡通过复杂的调控机制对机体起到保护或加重损害的作用，对不同组织及器官，在疾病的不同阶段有着特殊影响。因此，进一步阐明坏死性凋亡在脓毒症中的作用及其调控机制，不仅有助于对细胞死亡模式的深入理解，还将在坏死性凋亡相关靶点治疗脓毒症的选择中发挥重要作用。