放化疗性口腔黏膜炎动物模型的研究进展与比较

2022-11-15陈冬梅娄彦妮贾立群

海南医学院学报 2022年15期

陈晨，于然，陈冬梅，邓超，娄彦妮，贾立群

（1.北京中医药大学中日友好医院临床医学院，北京 100029；2.中日友好医院，北京 100029）

口腔黏膜炎（oral mucositis，OM）是放化疗常见的不良反应之一。OM 主要表现在口腔黏膜的红斑、溃疡并伴随疼痛，间接导致患者摄入减少而带来体重下降［1］，OM 显著降低生存质量，影响癌症治疗方案的进行［2］。并且容易继发感染，严重者威胁生命。有数据显示头颈部肿瘤放疗患者中80%以上会出现OM［3］，接受同期放化疗者超过90%会出现OM［4］。目前针对放化疗相关OM 尚无基于生物学的常规预防或治疗方法，当前主要集中在减轻疼痛和不适等［5］。因此，找到基于生物学的防治方法是当前迫切需要解决的问题。为进一步研究其发生机制及防治方法，需要构建动物模型。本文检索了近6 年相关文献，对动物选择及造模方法进行介绍并比较，以期为进一步研究提供参考。

1 造模动物选择及对比

造模动物包括金黄地鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、小型猪，其中以金黄地鼠、小鼠、大鼠应用较广泛。选用啮齿类实验动物优点在于其开展实验成本较低，实验操作方便，便于开展大样本实验，并且已开展的研究中多数采用啮齿类动物，模型较成熟。缺点在于：（1）啮齿类实验动物口腔结构以及口腔对于放射线的反应与人类差异较大。（2）啮齿类动物因体型较小，放射线照射时难以完全屏蔽颅脑及其余重要脏器，放射线对重要脏器的影响容易致死；并且口腔黏膜体积较小，对口腔黏膜的观察较困难，取材时难以获取足量的组织样本，此类问题以小鼠最常见。（3）啮齿类动物难以动态监测血液指标的变化［6］。选用小型猪优点在于其口腔组织结构与人类相似度较高，对于放射线的反应与人类更接近。并且由于体型较大，便于放射线放射区域的限定，便于多次采集血液样本、观察口腔黏膜及采集组织进行检测。但由于成本较高，难以大样本开展，并且采用的研究较少，模型较不成熟。

啮齿类动物中，金黄地鼠的优点在于：口腔颊囊大，易于对口腔黏膜进行操作及观察。但其缺点在于：（1）颊囊结构特殊，缺乏组织相容性抗原，属于免疫豁免区，不具有典型代表性；（2）动物品系不全面，难以满足某些特定的品系需求。大鼠、小鼠的优点在于种纯、品系丰富等，缺点在于口腔黏膜观察及操作较困难。豚鼠则有价格较高、品系不全面等问题，并且应用的研究较少。

2 造模方法选择

2.1 化疗模型

2.1.1 化疗联用局部刺激

2.1.1.1 化疗联用局部机械刺激化疗联用局部机械刺激模型应用较广泛，多数采用金黄地鼠。化疗方法为腹腔注射5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-fu）。5-fu 广泛应用于临床，治疗结肠癌、乳腺癌及胃癌等。这种造模方法最初由Sonis 等［7］提出，该研究采用金黄地鼠为模型动物，在实验的第0、5、10 天以每次60 mg/kg 的剂量腹腔注射5-fu（该研究注明，该剂量保证了造模的成功，并且造成的全身性疾病发病率及死亡率最低），并且每日将颊囊外翻，用18 号针头水平浅表地刮擦两次以刺激颊囊黏膜，直到颊囊出现红斑改变为止。大多数动物机械刺激2 次即达到目的。对照组仅进行连续3 d 的相同机械刺激。在第10 天注射5-fu 后，试验组表现出较明显黏膜炎，其组织学特征是上皮破坏和表面坏死，并在实验第16 天黏膜愈合。对照组在机械损伤后仅出现局部黏膜损伤及局部脓肿，并在24～48 h 内快速自发愈合。

此后有多个研究采用这种化疗联用机械刺激的造模方法，改进了动物选择或模型构建方案。有研究采用金黄地鼠与BALB/c 小鼠两种动物［8］，两种动物分别分为化疗+机械刺激组及化疗组，并对比组间的差异。金黄地鼠的机械刺激部位为颊囊黏膜，小鼠为舌黏膜。结果显示，与单用化疗组相比，5-fu+机械刺激组表现出严重的口腔溃疡，OM评分显著提高，并且体重显著降低（P＜0.01）。该实验表明5-fu+机械刺激的造模效果优于单用5-fu。Usumez 等［9］采用wistar 大鼠，实验第1 天及第3 天分别向腹腔内注射100、65 mg/kg 的5-fu，第3 天及第5天用18 号针尖对左侧颊囊黏膜进行刺激。Antunes等［10］、Barbosa 等［11］、Barbosa 等［12］、Medeiros 等［13］参考了Sonis 等［14］的造模方法，均采用金黄地鼠，在第1、2 天分别以60 mg/kg 及40 mg/kg 的剂量腹腔注射5-fu，第4 天机械刺激黏膜，炎症高峰期在实验第10 天出现。其余造模方法包括对金黄地鼠，在第0、2、4 天腹腔注射60 mg/kg 5-FU，1、2、4 天进行机械刺激［15］。因金黄地鼠特殊的口腔颊囊结构，化疗联用局部机械刺激的模型多数采用金黄地鼠为实验动物。

2.1.1.2 化疗联用局部化学刺激化学刺激主要为高浓度乙酸局部刺激口腔黏膜。该方法最初于1998 年由日本学者藤泽健司提出，该研究在家兔口腔黏膜局部应用乙酸而产生溃疡。后经逐步完善，将之与化疗相结合，用于研究化疗所致OM 的动物模型构建中。Takeuchi 等［16］选择ICR 小鼠造模，探索造模方案。实验分为5-fu 组及5-fu+乙酸组。5-fu 组分别在不同实验时间腹腔注射相应剂量的5-fu后，未发现口腔溃疡的产生。其中60 mg/kg 剂量组产生较高死亡率。对于5-fu+乙酸组，在5-fu 的基础上，第0 天对一侧颊黏膜分别注射不同剂量的20%乙酸，观察到口腔溃疡的产生。该研究最终选择最佳剂量为50 mg/kg 的5-fu 联用15 μL 的20%乙酸注射。Takeuchi 等［17］同样进行剂量对比，采用wistar 大鼠，在实验开展前5、3、1 d 腹腔注射5-fu，实验第0 天对右侧颊囊注射25 μL 乙酸溶液。最终确定了每次40 mg/kg 的5-fu 剂量，及25%的乙酸溶液浓度。除此之外，有学者采用wistar 大鼠，腹腔注射5-fu 联合浸泡浓乙酸的滤纸贴敷口腔黏膜的方法，同样可有效造成口腔溃疡［18，19］。2.1.2 单用化疗模型

2.1.2.1 腹腔注射化疗药物单纯腹腔注射化疗药

物可以诱发OM，但不能诱发口腔溃疡。Ahmed等［20］选用Wistar 大鼠，腹腔内单次注射甲氨蝶呤（剂量为20 mg/kg）造模，注射4 d 后处死。结果表明，注射甲氨蝶呤可诱发OM，组织学特征符合初始的炎症/血管期，不能诱发口腔溃疡。Al-Azri等［21］的研究，对Agouti大鼠进行单剂量伊利替康（200 mg/kg）腹腔注射，72 h 内对大鼠进行处死，仅发现口腔黏膜上皮厚度减少，未发现溃疡。原因是大鼠口腔黏膜与人的口腔黏膜组织学有差异，大鼠单纯应用化疗药物不能诱发口腔溃疡。但由于该研究观察时间过短，可能OM 炎症高峰期尚未到达，因此结论不够严谨。2.1.2.2 静脉注射化疗药物通过静脉注射化疗药物的研究较少。Bertolini 等［22］采用C57/BL6 小鼠，每48 小时以50 mg/kg 的剂量尾静脉注射5-fu，持续13 d，并于第14 天处死。并设立腹腔注射的对照组，以每日100 mg/kg 5-fu 的剂量注射4 d，并在第5天处死。结果显示：腹腔注射组迅速产生体重下降及肠炎，但未见口腔炎性改变，无炎性介质表达的变化。而静脉注射组产生了口腔及食管上皮的萎缩和细胞增殖减少、凋亡增加，伴有炎性介质的变化，并可见外周血中性粒细胞的减少及口腔黏膜局部中性粒细胞的浸润，伴随着口腔黏膜连接蛋白（ecadherin protein）水平的降低。通过对比，该研究认为腹腔注射化疗药物不能诱发OM，并且静脉注射比腹腔注射的优势在于：（1）能在口腔上皮中触发显著的炎症反应，并且不会严重丧失肠功能；（2）更好地模拟目前大多数人类应用5-fu 的方案。该研究对于腹腔注射组的结论与其他文献不同，可能与该研究对于腹腔注射组的观察时间过短，并未达到炎症高峰期相关。

2.2 放疗模型

2.2.1 单用放疗模型许多研究采用放射线照射的方法造模，不同研究采用的照射方法不同，包括单剂量照射及低剂量分割照射。照射剂量及照射位置也有所不同，位置包括吻部、单侧颊黏膜、牵引出口腔外的舌头等位置。根据Han 等［23］所述，给予小鼠每天8 Gy，连续3 d 的辐射模拟了临床低剂量分割放射，并且是诱发OM 的最小剂量，小鼠在照射开始第9 天出现口腔溃疡。Kowaliuk 等［24］及Sylvia等［25］对小鼠每天采用3 Gy，1 周内连续照射5 d，共照射2 周的造模方法。Hu等［26］采用小型猪，在进行了多剂量对比研究后，最终确定了以每天6 Gy，连续5 d 的剂量，既能诱发显著OM，并且动物体重及口腔黏膜得以恢复。部分研究对单剂量照射及分割照射进行对比。有研究采用C57BL/6J 小鼠，对小鼠头颈部使用16.5 Gy 的单剂量照射或每天8 Gy，连续3 d的分次照射［27］。结果显示：单剂量16.5 Gy 照射能使所有小鼠产生舌黏膜溃疡，小鼠体重较初始体重均下降45%以上，并且所有小鼠在15 d 内死亡。表明大剂量单次照射的致死率较高。Tao 等［28］采用C57/BL6 小鼠，对头颈部进行放射，该研究选择25 Gy 作为快速诱导放射性黏膜炎的最佳剂量。而Muhammad 等［29］采用BALB/c 小鼠，则认为18 Gy 的剂量为最佳，在保证溃疡持续时间足够长的同时，可以保证100%的存活率。Kowaliuk 等［30］对C3H/Neu小鼠设立单剂量照射及分割照射分组研究。单剂量照射舌头诱发黏膜溃疡ED50剂量为（18.3±4.3）Gy，诱发溃疡的平均潜伏期为（10.8±0.6）d，平均溃疡持续时间为（3.5±0.8）d。分次照射（3 Gy/d×5 d/周×2 周）的ED50为（9.3±1.8）Gy，平均潜伏期为（7.9±0.6）d，溃疡持续时间为（4.6±1.1）d。Li 等［31］对平均体重为300 g 的豚鼠进行单剂量30 Gy的剂量照射造模。近5年的研究中，对小鼠采用单剂量照射剂量为16～25 Gy［28，32］，对大鼠的单剂量为15～20 Gy［33.34］，不同研究得出的最佳造模剂量有所差异。对于金黄地鼠，Watanabe 等［35］采用剂量分别为20、30、40、50 Gy 的单剂量照射，最终得出：OM 的严重程度随放射剂量增大而增大，但在放射剂量达40 Gy 时OM 已达最严重程度，不再与剂量相关。

2.2.2 放疗联用局部刺激模型 Shen［36］采用放疗联合化学刺激的方法，对C57 小鼠进行单剂量16 Gy 照射口腔，配合浸泡浓乙酸的滤纸贴敷口腔黏膜以诱发OM。有研究认为单纯应用放射线照射仅能引起轻微病变，因此该研究加用了机械刺激。该研究对金黄地鼠采用单次35 Gy 的Co-60 照射，配合照射3 天后机械刺激，可诱发严重OM［37］。

2.3 放化疗联用模型

Choi 等［38］采用Balb/c 小鼠，在实验的第0 天，以100 mg/kg 的剂量腹腔注射5-fu，注射30 min 后，给予20 Gy 的放射线照射，照射分两次进行，每次10 Gy，中间间隔5 min。在实验第9 天处死并取舌头进行组织分析，证实可以诱发OM，并且试验期间无实验动物死亡。

3 造模方法对比

3.1 化疗模型

注射化疗药物包括腹腔注射及静脉注射，腹腔注射操作简便，但对肠功能影响较大。静脉注射能更好地模拟人类化疗方案且不影响肠功能，但其操作相对于腹腔注射难度较大，且采用该方法的研究较少。

3.1.1 化疗联用局部刺激模型局部刺激模拟临床的慢性刺激过程，意义在于诱发局部口腔黏膜的严重OM，便于观察及检测。优点：能准确诱发严重OM 及口腔溃疡。缺点：（1）刺激难以定量及标准化，机械刺激需保证对不同动物刺激量相同，但却难以定量；（2）不符合临床实际，尤其是化学刺激，模拟临床的相似度较低；（3）操作难度较大，尤其是机械刺激，要求在口腔黏膜浅表刺激，不能造成黏膜破溃，对操作者要求较高。

3.1.2 单用化疗模型优点：操作步骤较少。缺点：难以诱发严重OM 及口腔溃疡，效果不确切。

3.2 放疗模型

放射线照射需要屏蔽其余部位，若屏蔽不完全，容易损伤颅脑及其余重要脏器而致死。放射线照射分为大剂量单次照射及小剂量分割照射两种，照射位置包括吻部、单侧颊黏膜、舌头等。大剂量单次照射诱发OM 效果较好，但致死率较高，并且与临床应用不同。小剂量分割照射致死率较低，较符合临床，但诱发严重OM 效果相对较差，并且需要多次麻醉，对实验动物影响较大。

3.2.1 单用放疗模型优点：操作较简单。缺点：诱发严重OM 及口腔溃疡的效果不确切。

3.2.2 放疗联用局部刺激模型优点：能准确诱发严重OM 及口腔溃疡。缺点：黏膜刺激难以定量及标准化、操作难度大、不符合临床实际。

3.3 放化疗联用模型

对于动物整体状况影响较大；诱发严重OM 及口腔溃疡的效果不确切。

除此之外，还有两个问题值得关注：（1）观察口腔黏膜需要对动物多次麻醉，多次麻醉对于动物本身的影响。为避免多次麻醉，部分研究如Mangoni等［39］采用Parkins 等［40］建立的嘴唇评分系统来评价OM，这类评价系统是否可行。（2）联用颊黏膜局部刺激的研究观察的是颊囊黏膜，不联用局部刺激的研究多数观察舌背黏膜的变化，颊囊黏膜与舌背黏膜对于放化疗的反应或对于药物的反应有所不同。

4 小结

目前各种放化疗性OM 动物模型构建方法都存在其不足。模型动物包括金黄地鼠、小鼠、大鼠、豚鼠、小型猪，以前3 种应用较广泛。金黄地鼠便于进行口腔的观察及操作，大鼠、小鼠种纯、价廉、品系丰富。造模方法包括化疗联用局部刺激、单用放疗、单用化疗、放疗联用局部刺激、放化疗联用，以前两种造模方法应用较广泛。放化疗难以准确诱发严重OM 及口腔溃疡，往往需配合局部刺激才能保证其成功率，但局部刺激难以定量及标准化，难以保证其临床模拟程度。现有各种方法都难以达到操作简便、符合临床实际、并且能准确诱发严重OM 的目标。