口蹄疫病毒感染与复制多元调控因素研究进展

方满新 (宜春学院 生命科学与资源环境学院，江西 宜春 336000)

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的牛、绵羊、山羊、猪等偶蹄类动物最具传染性的病毒性疾病之一，在许多国家，造成了严重的经济损失，世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的传染病，中国政府将其规定为一类动物疫病。现阶段针对FMD有效的防控策略主要是疫苗接种及屠宰染疫动物，但由于当前FMD疫苗局限性，FMDV感染对养殖业发展依然构成严重威胁。

在FMDV感染过程中，病毒一方面需要利用宿主细胞成份为其感染复制创造有利环境，同时宿主在病毒进入自身后，会启动其防御机制抵抗、削弱、甚至清除病毒感染。随着FMDV和宿主互作研究的分子生物学等相关技术的发展，FMDV与宿主相关作用的机制被相继探明，了解FMDV感染复制机制影响因素对于开发新的预防和治疗策略及新靶点具有重要意义，因此，基于现有研究成果，现总结分析最近几年在FMDV感染与复制调控影响因素方面的研究新进展，以期为FMDV有效防控研究提供参考。

1 FMDV结构特征及其感染与复制

FMDV是一种正二十面体单股正链RNA病毒，无囊膜，属小RNA病毒科口蹄疫病毒属，基因组RNA全长约8.5 kb。FMDV基因组由5′端非编码区(5′-UTR)、1个长开放阅读框(ORF)和3′端非编码区(3′- UTR)及Poly(A)尾巴组成。开放阅读框编码的多聚蛋白前体被病毒编码的蛋白酶(Lpro和3Cpro)裂解，产生多种不同的蛋白以及前体物质，包括4种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)、至少10种非结构蛋白(L、2A、2B、2C、3A、3B1、3B2、3B3、3C和3D)等。

FMDV在宿主细胞内的复制步骤主要包括与细胞受体结合,脱壳,病毒RNA进入细胞浆,病毒蛋白合成以及病毒RNA复制,最后装配成完整的子代病毒粒子。病毒感染起始首先进行的是病毒与受体吸附，FMDV通过病毒粒子VP1 G-H环中受体结合基序RGD与易感细胞膜上的表面受体整联蛋白或硫酸乙酰肝素发生特异性结合，随后病毒粒子通过细胞胞饮跨过细胞膜进入细胞，病毒粒子在细胞质中包裹于膜泡内，在膜泡表面形成孔状结构后，病毒RNA通过孔状结构进入细胞质，但进入细胞质的病毒RNA不能单独完成病毒复制和以mRNA为模板翻译病毒蛋白，需通过劫持利用宿主细胞核糖体和翻译起始因子合成病毒蛋白。FMDV基因组5′-UTR的IRES核心功能区结合核糖体亚基和真核翻译起始因子形成病毒翻译起始复合物，起始复合物沿着病毒正链RNA移动，通过复杂的生化反应和构象变化启动病毒多聚蛋白的合成及延伸，在延伸的同时多聚蛋白通过多种蛋白酶进行初级和次级裂解，首先裂解成P1、2BC和P3前聚蛋白，P1再通过蛋白酶裂解成VP1、VP0以及VP3，2BC 裂解成2B和2C，P3生成3A、3B、3Cpro以及 3Dpol，随后病毒RNA复制启动，包括形成复制复合体及复制引物，病毒复制复合体中3D聚合酶催化病毒负链RNA合成，进而以新合成的负链RNA作为模板合成正链RNA，随后将合成的病毒蛋白与正链RNA包装形成病毒粒子并通过裂解性方式破坏细胞而释放。

2 影响FMDV感染与复制的宿主因素

FMDV作为高度依赖于宿主细胞的寄生生物，在感染宿主细胞的过程中，其病毒蛋白或基因组广泛地与促进或阻碍病毒复制的宿主因子相互作用，这种病毒-宿主之间互作的平衡趋势决定了病毒的最终命运。通过研究FMDV与宿主细胞因子间的相互作用可以加深对FMDV的认识，是当前该领域内研究的热点和重点。

2.1 促进FMDV感染与复制的宿主因子在FMDV感染过程中，病毒已经发展出非常复杂的机制来破坏宿主防御，并从细胞机制中招募蛋白质因子支持自身复制。先天免疫是宿主抵御致病性感染的第一道防线。干扰素(IFNs)是由病毒感染或其他刺激物诱导宿主细胞分泌的一类可溶性糖蛋白，干扰素刺激基因(ISGs)是一组受IFNs调控的抗病毒基因，其蛋白产物在病毒复制周期不同阶段直接或间接抑制病毒繁殖。在病毒感染后，宿主免疫系统采用的主要防御策略是诱导Ⅰ型IFN，IFNs与细胞膜上的特异性受体结合，触发信号转导级联和调控ISGs表达，最终发挥抗病毒功能。在感染过程中，FMDV能够操纵宿主细胞进行病毒复制和逃避宿主免疫反应。MicroRNA(miRNA)是由两种RNaseⅢ蛋白Drosha和Dicer产生的非编码RNAs，长度约为22 nt，在基因转录调控中起重要作用。研究表明miRNA可以直接或间接调控病毒感染。REN等[1]和WANG等[2]等分别发现FMDV感染可直接上调miR-4331-5p和miR-4334-5p表达，转染miR-4331-5p和miR-4334-5p模拟物或抑制剂可促进或抑制FMDV复制。机制研究表明miR-4331-5p通过抑制Ⅰ型IFN途径促进FMDV复制，ID1是miR-4334-5p直接靶点，通过调节IFN通路抑制FMDV复制，这些发现为在FMDV感染过程中通过靶向目标miRNA以干扰病毒复制提供可能途径[3-4]。

DDX56解旋酶(DDX56)是一种RNA解旋酶，DDX56与FMDV非结构蛋白3A互作抑制IRF3磷酸化进而抑制Ⅰ型IFN，促进FMDV复制[5-6]；多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)被发现与FMDV VP0相互作用，促进PCBP2降解天然免疫接头蛋白VISA，抑制IFN-β产生[7]；FMDV前导蛋白酶(Lpro)与转录因子活性依赖性神经保护蛋白(ADNP)互作并抑制IFN和ISG的表达[8]；宿主蛋白程序性细胞死亡因子10(PDCD10)负调控Ⅰ型IFN通路信号分子及下游ISGs转录，抑制Ⅰ型IFN产生，从而促进FMDV复制[9]。 ZHANG等[10]揭示p53基因在FMDV复制及对小鼠致病性中的生物学功能，发现在感染早期，FMDV经非MDM2特异性泛素化-蛋白酶体途径抑制p53基因表达，宿主主要以炎症反应抵抗感染。长期感染中，FMDV有效复制需要p53，p53缺失抑制FMDV复制，p53敲除细胞免疫相关基因IFNB-1、IRF-3、ISRE、TNF、IL6、RIG-I、MDA-5等表达增强，从而抑制FMDV复制，并促使小鼠对FMDV感染更具抵抗力，显示p53为FMDV抑制先天免疫进而实现有效复制所必需。

此外，其他一些FMDV诱导并促进其复制的宿主因子包括热休克蛋白家族B成员1(Hspb1)基因[11]、肿瘤进行性位点2(TPL2)[12]、多聚(rC)结合蛋白2[13]、宿主核糖体蛋白SA[14]等，其中多聚(rC)结合蛋白2与VP0相互作用，宿主核糖体蛋白SA与FMDV衣壳蛋白VP1互作，均可促进病毒复制。

2.2 抑制FMDV感染与复制的宿主因素在病毒感染的细胞中，宿主限制因子通过多种途径在病毒生命不同阶段与病毒相互作用，从而干扰阻断病毒复制。一方面，许多宿主限制因子通过增强IFN或ISGs表达来抑制FMDV复制。研究表明FMDV通过Cdh1介导的泛素化促进DNA结合抑制剂1(ID1)降解以促进其复制。机制研究显示叉头框蛋白O1(FOXO1)作为ID1伴侣，抑制IFN调节因子3表达和IFN产生，进一步研究发现ID1通过HDAC4介导的去乙酰化抑制FOXO1转录活性，促进IFN产生和抗病毒免疫应答[15]。其他还包括早期生长反应基因-1(EGR1)[16]、酯酶D(ESD)[17]、膜联蛋白A1(ANXA1)[18]等通过增强Ⅰ型IFN途径信号转导抑制FMDV复制。

另一方面，许多宿主蛋白通过与病毒蛋白的相互作用来抑制FMDV复制。 FMDV结构蛋白VP1在病毒诱导抗体应答、吸附和侵入过程中发挥重要作用。一些宿主因子通过与VP1互作抑制FMDV复制，LIU等[19]鉴定与VP1相互作用的宿主细胞蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶3(STK3)，显示VP1羧基末端(氨基酸180-214)是其与STK3互作的关键并抑制病毒复制；此外FMDV VP1互作蛋白DNAJA3，DNAJA3的J结构域氨基酸(aa)1-168和VP1赖氨酸208(K208)位点对DNAJA3与VP1相互作用至关重要。进一步机制研究揭示DNAJA3通过诱导VP1溶酶体降解，并减弱其在β-IFN信号通路中的拮抗作用，抑制FMDV复制[20]。FMDV VP1与TPL2互作，并抑制TPL2 Thr290位点介导的IRF3/IFN-β信号通路，促进病毒复制[21]。TPL2、p105和ABIN2的三聚体复合物对于维持TPL2稳态水平和宿主细胞对病原体的反应至关重要。HAO等[22]确定TPL2激酶结构域中的268～283氨基酸是与VP1互作所必需的，VP1破坏TPL2-p105-ABIN2复合物的稳定性，通过降解TPL2并破坏其复合物的抗TPL2抗病毒活性。

其他宿主蛋白与病毒蛋白互作还包括FMDV非结构蛋白2B与亲环蛋白A(CypA)相互作用，CypA通过蛋白酶体途径降低FMDV-Lpro和3A水平，调节病毒复制[23]；3B蛋白与病毒RNA传感器RIG-I相互作用，3B蛋白对RIG-I介导免疫信号的抑制降低IFN-β、ISGs和促炎性细胞因子表达，进而促进FMDV复制[24]；FMDV 3A的N末端15～21氨基酸残基负责3A和波形蛋白之间的相互作用并负调节FMDV复制[25]；RNA解旋酶DDX1与病毒蛋白3D相互作用并以ATP酶/解旋酶活性依赖的方式抑制FMDV复制[26]。

FMDV作为RNA病毒，其蛋白的翻译是依赖其5′端非翻译区翻译调控的顺式作用元件——内部核糖体进入位点(IRES)以非帽依赖性方式完成，IRES介导的翻译起始是RNA病毒复制的关键步骤之一，口蹄疫IRES属于Ⅱ型IRES，FMDV IRES强烈依赖于细胞解旋酶和IRES转录因子(ITAFs)，内部启动的调节需要ITAF与IRES相互作用，其过程涉及病毒与宿主细胞蛋白之间复杂的联系且与病毒的嗜性和毒力相关，是近年来病毒学研究的热点领域之一。 RNA解旋酶23(DDX23)是一种宿主核螺旋酶，FMDV感染抑制了DDX23表达，进一步研究显示DDX23直接与FDMV IRES结合，对FMDV IRES依赖性翻译有负面影响，显示DDX23具有抑制FMDV感染功能，这可能是抗病毒药物设计的一个有用靶点，有助于将来探索新的抗病毒策略并生产新型疫苗[27]。SUN等[28]发现核不均一核糖核蛋白 L(hnRNP L)以其RNA识别基序RRM3-4与IRES结构域D4-5结合，导致FMDV复制明显受到抑制，研究机制显示hnRNP L抑制病毒RNA合成而不是阻止IRES介导的翻译起始来抑制FMDV复制。这些研究不但具有基础病毒学理论价值，而且具有临床病毒学应用潜力；此外一种新的ITAF，即异质核核糖核蛋白K(hnRNP K)负调控FMDV翻译和病毒复制，进一步研究表明hnRNP K的KH2和KH3结构域直接与FMDV IRES的Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ结构域结合，通过干扰另一个ITAF即多聚嘧啶串结合蛋白(PTB)的识别而抑制IRES介导的翻译，hnRNP K介导的抑制作用被病毒3C蛋白酶通过切割hnRNP K Glu-364残基拮抗[29]；宿主蛋白eEF1a与FMDV IRES相互作用并抑制FMDV复制[30]。

此外，一些研究显示宿主因子直接抑制FMDV复制。宿主miR-1307通过破坏病毒结构蛋白VP3稳定性和增强宿主天然免疫应答抑制FMDV复制，注射miR-1307-agomir显著延缓FMDV诱导的乳鼠死亡，表明这种天然内源性miRNA对FMD的治疗潜力[31]。HAN等[32]发现FMDV感染后Sec62与IRE1a、RIG-I以及下游抗病毒信号通路激活呈正相关，表明Sec62是一个重要的抗病毒因子，FMDV通过下调Sec62-IRE1a/RIG-I逃避宿主抗病毒防御机制；宿主Arf6通过阻止FMDV入侵发挥抗病毒作用，第48位氨基酸是Arf6抑制FMDV入侵的关键位点[33]；FMDV感染细胞Gα12的mRNA和蛋白水平都有所上调并抑制FMDV在PK-15细胞上复制[34]；TPL2基因敲除有利于FMDV复制[35]。

除了宿主因子直接抑制FMDV复制外，FMDV也在感染后拮抗部分宿主因子以利于其复制。NOD2是NOD样受体家族重要成员，研究首次揭示FMDV感染可以激活NOD2介导的IFN和NF-κB信号通路，FMDV 2B、2C和3Cpro蛋白拮抗NOD2抗病毒作用，降低NOD2蛋白表达，并鉴定出2B、2C与NOD2的互作位点为2B的aa105～aa114和2C的aa116～260 段[36]；受体相互作用蛋白2(RIP2)是NOD2下游的一种特异性衔接分子并抑制FMDV复制，在FMDV感染过程中对IFN-β和NF-κB信号通路的激活发挥了重要作用，FMDV 2b、2C、3Cpro和Lpro蛋白是导致RIP2蛋白减少的主要原因[37]； 过氧化物酶-6(PRDX6)过表达抑制FMDV复制，病毒3Cpro诱导PRDX6降解以拮抗PRDX6介导的抗病毒功能[38]；核苷二磷酸激酶1(NME1)抑制FMDV复制，2B和VP4蛋白被鉴定为诱导NME1减少的病毒因子[39]。

近几年在研究FMDV和宿主因子关键互作方面已经取得了相当大的进展，上述研究从miRNA、基因及蛋白等多方面研究了宿主因素在调控FMDV感染复制中的促进与抑制作用以及FMDV在感染后通过操纵不同的宿主因子抑制抗病毒应答，这些研究将有助于深入理解FMDV致病与机体抗病相关机制及探索一些有前途的抗病毒靶点，用于FMDV感染的诊断和治疗。

3 调控FMDV感染与复制的病毒自身因子

在FMDV基因组结构中，成熟病毒粒子的形成需要结构蛋白、非结构蛋白参与病毒RNA复制。在非结构蛋白中，3A蛋白在N-末端区域没有发现缺失，但在C-末端部分发现了大量的缺失和替换。3A蛋白的某些缺失与FMDV的宿主范围和毒力有关，也有研究表明一些分离株在3A的C末端编码区有不同的缺失，表明这些缺失对FMDV的传染性不是必需的[40]。最近的观察进一步揭示了3A的C末端区域(aa81～153)对于FMDV细胞培养复制是可有可无的[41]。虽然这项研究首次表明FMDV能够耐受3A中73个氨基酸的缺失，但3A中完整的C末端区域(aa77～153)高度可变，容易发生缺失和突变。LI等[42]研究发现aa80～153和aa77～153缺失以及3A-L76I和3A-L76V的替换不影响传染性病毒的产生，确认3A蛋白的aa77～153而不是aa81～153对于FMDV在细胞培养中的复制是非必要的，本研究对今后FMD标记疫苗的研制和外源基因的表达具有重要意义。

在发现弱毒ZBatt株与其亲本强毒株毒力衰减中编码3A蛋白的基因组变化的基础上，GAO等[43]研究3A蛋白变化对兔化弱毒株ZBatt病毒复制和感染的影响，通过将强毒株ZBatt病毒的3A基因导入其弱毒疫苗ZBatt株，数据显示3A蛋白的变化可能与ZB病毒的减弱有关，3A蛋白的突变影响ZB病毒在自然宿主细胞中的复制能力和毒力，ZBatt病毒的3A蛋白被认为是毒力主要决定因素之一。FMDV的多蛋白翻译在两个不同的起始点(Lab-AUG和Lb-AUG)起始，YUAN等[44]将Lb起始的AUG突变为多种非AUG密码子(UGG、AUC、CUG和AAA)，获得了4个经Lb-AUG修饰的FMDV突变体，分析显示FMDV突变体在BHK-21细胞中的生长及病毒滴度与野生型(WT)病毒无显著性差异。在PK-15细胞中，FMDV突变体K4m和K9m病毒产量明显低于WT病毒，进一步研究显示这种减毒表型与延迟eIF4GI切割和抑制IFN表达能力降低相关，由于前导蛋白(L)负责eIF4GI的切割和IFN表达的抑制，因此在FMDV突变体感染期间检测体内L蛋白的合成，显示Lb-AUG修饰对L蛋白翻译活性有负面影响，FMDV起始密码子的精确工程化为生产灭活抗原疫苗提供了一个安全平台。

其他一些参与猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染与复制的病毒自身因子包括O型FMDV VP3G-H环中氨基酸突变(VP3上第3 174位特征性氨基酸突变)影响O型FMDV感染宿主细胞的毒力及其内吞作用路径[45]。许多RNA病毒编码一种校对缺陷的低保真RNA依赖性聚合酶(RdRp)，以适应不断变化的病毒环境和阻碍抗病毒治疗。3Dpol是FMDV RdRp，3DpolN-末端编码一个核定位信号(NLS)序列MRKTKLAPT，对蛋白质导入宿主细胞核起重要作用，分析表明T19和L21 3Dpol氨基酸对于维持FMDV聚合酶的保真度和确保FMDV基因组可靠复制有重要作用[46]。

4 调控FMDV感染与复制的外源因素

FMD是一种急性、烈性传染病，其流行快速，染病率极高，不易控制和消灭。FMDV包括7个血清型：A型、O型、Asia1型、C型、南非(SAT)1，2，3型；此外，每个血清型内分化出许多亚型，不同血清型之间几乎没有交叉免疫性。目前，抗FMDV感染的抗病毒药物的开发正在积极探索并取得一定进展，通过几种替代策略如抗病毒药物、小RNA干扰疗法等或许有助于解决疫苗局限性问题。

高三尖杉酯碱为一种极具吸引力的抗病毒药物，GONG等[47]研究证实高三尖杉酯碱在IBRS-2细胞中以剂量和时间依赖性的方式抑制FMDV感染复制，为其在病毒感染早期可能作为抗病毒药物提供了初步证据；抗菌肽具有广泛的抗菌、抗病毒、抗肿瘤和免疫调节生物活性，研究发现合成的斜带石斑鱼抗菌肽epinicin-1(Epi-1)对FMDV有很好的抗感染作用，尤其是在病毒吸附时进行Epi-1处理，表明Epi-1可能是一种很有前途的抗FMD药物[48]；此外其他一些广谱抗病毒药物表明在体外/体内对FMDV有效，包括利巴韦林体外抗FMDV作用与其浓度成正比[49]；阿米洛利对2株FMDV具有剂量依赖性的抗病毒活性，而且阿米洛利不抑制FMDV在IBRS-2细胞中的附着和进入，但能阻止病毒的早期复制[50]；另外还包括阿比隆(ARB)[51]、咪唑立宾[52]、LiCl[53]等对FMDV复制有抑制作用。

另一方面，肌苷单磷酸脱氢酶(IMPDH)是嘌呤核苷酸生物从头合成的关键酶，二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)催化嘧啶核苷酸从头合成途径的第4步反应，位于线粒体内膜上，由于病毒的复制严重依赖于宿主的核苷供应，参与核苷酸生物合成的宿主酶可能是抗病毒药物开发的潜在靶点，抑制IMPDH可以降低RNA和DNA合成所需的细胞内鸟嘌呤核苷酸水平。LI等[54]探究显示一种IMPDH抑制剂merimepodib在体内外均能有效抑制FDMV感染；GONG等[55]评估两种IMPDH抑制剂(AVN-944和霉酚酸酯)和一种DHODH抑制剂(特立氟胺)对FMDV体外复制的影响，表明这些化合物能有效抑制FMDV(O/MY98/BY/2010和A/GD/MM/2013)感染且具有广谱性。

RNA干扰(RNAi)是目前正在探索的抑制FMDV复制和传播的方法之一，RNAi可以通过短发夹状RNA或人工小RNA(amiRNAs)来实现。通过在建立稳定细胞系基础上，表达针对FMDV基因组3个功能区(IRES、3B3和3D)的amiRNAs，结果表明以3D聚合酶为靶点的amiRNA相对更有效[56]；利用RNAi技术构建和筛选表达整合素β6亚单位特异性小干扰RNA分子(siRNAs)质粒，表明RNAi技术可能通过降低FMDV受体整合素β6的表达来抑制PEF细胞内病毒的复制[55]；通过设计一种短干扰RNA(siRNA)靶向FMDV-IRES中相对保守区域，结果显示设计的siRNA以浓度依赖方式抑制FMDV介导的翻译，为了维持这种抑制作用，设计了一种短发夹RNA(shRNA)慢病毒表达载体并显示在细胞培养中，慢病毒shRNA载体可显著抑制FMDV-IRES活性达2周[58]；齐兴财等[59]选取以O型FMDV ON株3C、3D、VPl蛋白基因作为靶基因，显示慢病毒介导siRNA抑制O型FMDV ON株病毒复制，在细胞的水平上挑选出有效抑制ON株FMDV复制的基因干扰片段，并成功制备慢病毒干扰载体，为后续抗FMDV的转基因羊生产培育奠定了试验基础。此外，通过研究猪瘟病毒(CSFV)与FMDV共感染对FMDV复制的影响，发现猪瘟病毒C株共感染FMDV能够抑制FMDV复制，为进一步研究CSFV和FMDV共感染的分子机制奠定了基础[60]。

上述这些研究从化合物及小RNA干扰疗法等不同方面探讨了不同外源性因素对FMDV感染与复制的调控抑制，表明这些因素作为一种潜在的有效策略，可用于开发新的抗FMDV感染药物，未来这些外源性因素在动物体内是否具有抗病毒作用及机制尚需进一步研究。

5 小结

在病毒-宿主漫长互作过程中，病毒为了与宿主共存进化出了许多策略逃避宿主的防御，正如以上综合分析可知，FMDV利用自身结构蛋白和非结构蛋白，参与其诱导产生的宿主过程，劫持、抑制或降解多种宿主蛋白，负调控免疫因子的产生，以多种途径突破宿主天然免疫防线，从而有利于其复制；另一方面，宿主细胞作为FMDV生命活动的载体，在感染后动用高度复杂的防御系统来抵御FMDV的入侵，开展FMDV与宿主相互作用的研究，揭示更多FMDV与宿主互作机制，有助于深入洞悉FMDV感染与宿主抗感染的内在联系，为揭示病毒的致病机制和发现新的抗病毒靶标奠定基础和提供思路，也对疫苗研发提供理论指导。FMDV与宿主的互作机制等及其致病问题将一直是研究的重点。