变形链球菌菌斑生物膜初期粘附机制研究进展

胡丹阳， 李 兰， 张锦龙， 张妍妍， 王成龙

1.联勤保障部队大连疗养院小平岛疗养区 十科，辽宁 大连116023；2.联勤保障部队综合训练大队 卫勤训练队卫勤教研室，辽宁 大连116000；3.解放军总医院第五医学中心 口腔科，北京 100039

细菌生物膜是微生物在自然界中的一种独特存在方式。 与浮游细胞相比，细菌生物膜具有更加适应复杂生存环境的特点[1]。 99%以上的自然界中细菌以生物膜形式存在，60%以上临床患者发生感染均与细菌生物膜的形成有关[2-3]。 有研究表明，与浮游状态的同种细菌相比，存在于菌斑生物膜中的变形链球菌具有更强的毒力、更大的耐药性以及更高的对抗宿主免疫防御能力。 变形链球菌能否在口腔环境中长期存活并发挥其致龋特性，与菌斑生物膜这一特殊结构密切相关。 生物膜的发展过程可分为可逆吸附阶段、不可逆吸附阶段、微菌落阶段、成熟阶段、从生物被膜解离阶段。 菌斑生物膜的形成具有初期非特异且微弱，后期特异且高亲和力的特点，探究其初期粘附机制对于龋病防治具有重要意义[4]。 作为主要致龋菌，变形链球菌的初期粘附是其发挥致龋作用的关键。 本文对变形链球菌菌斑生物膜初期粘附机制的研究进展予以综述。

1 蔗糖依赖机制

1.1 葡糖基转移酶 葡糖基转移酶(glucosyltransferase，GTF)为变形链球菌的重要致病因子之一，在细菌附着和菌斑形成中发挥重要作用[5]。 失活变链GTF 会导致其蔗糖依赖的粘附明显降低，生物膜结构发生改变，且致龋力也有不同程度下降[6]。GTF 可特异性以蔗糖为底物合成葡聚糖，变形链球菌中至少包含3 种葡聚糖，分别为GTF-B 编码的GTF-I，GTF-C 编码GFT-SI，GTF-D 编码的GTF-S[7]。GTF-I 主要合成非水溶性葡聚糖；GFT-SI 既合成非水溶性葡聚糖又合成水溶性葡聚糖；GTF-S 主要合成水溶性葡聚糖[7]。 GTF 以蔗糖为底物合成的葡聚糖沉积于牙齿表面的获得性膜，而葡聚糖的葡萄糖残基为细菌表面的GTF 继续提供结合位点，使得变形链球菌特异性粘附于获得性膜，进一步介导了细菌对牙齿表面的粘附[8-9]。 GTF 具有与其他细菌细胞结合的能力，即使不是合成自身糖基转移酶的细菌。 因此，GTF 与微生物之间的相互作用使得细菌细胞之间能够相互连接，并牢固粘附于牙齿表面[10]。

1.2 葡聚糖结合蛋白 作为变形链球菌蔗糖依赖性粘附机制的另一个重要致病因子，葡聚糖结合蛋白(glucan-binding protein，Gbp)能够介导细菌与葡聚糖结合，但无GTF 活性。 Gbp-A、Gbp-B、Gbp-C、Gbp-D 4 种类型的蛋白质均在细菌粘附和生物膜形成中具有关键作用。 葡聚糖可以分为水溶性葡聚糖与非水溶性葡聚糖[11]。 水溶性葡聚糖主要含有α-1，6-糖苷键，而非水溶性葡聚糖主要含有α-1，3-糖苷键。游离的GTF 在牙面获得性膜内合成葡聚糖，α-1，6-糖苷键可以被变形链球菌表面的Gbp 活性部位即葡聚糖结合功能区(glucan-binding domain，GBD)识别结合，进而介导细菌对于获得性膜的初始粘附。 Gbp 通过活性部位与葡聚糖结合，疏水端与变形链球菌菌体结合，使菌斑生物膜的结构更加紧密，在菌斑成熟过程中起到重要作用。 Gbp可以与α-1，3-糖苷键结合介导非水溶性葡聚糖的粘附[11]。 Banas 等[12]研究认为，GBD 含有大量β折叠结构，灵活的β 折叠结构可能与介导非水溶性葡聚糖的粘附相关。

2 非蔗糖依赖机制

表面抗原I/Ⅱ家族(细菌粘结素)不仅存在于变形链球菌表面，还存在于化脓性链球菌、无乳链球菌或猪链球菌等其他微生物中。 在编码表面抗原I/Ⅱ的6 种基因序列中，富含脯氨酸的P 区和富含丙氨酸的A 区均能够通过调节变形链球菌等口腔链球菌在牙表面的粘附，非特异性的结合唾液糖蛋白，从而参与生物膜的形成。 A 区、V 区编码出现在细菌细胞表面上的粘附性表位，这些粘性表位与唾液糖蛋白具有亲和力。 有研究证实，A 区、P 区、V 区突变的菌株均不能粘附到唾液包被的固体表面。 AgI/Ⅱ家族的SpaP 蛋白与唾液中发现的糖蛋白-340(glycoprotein-340，gp-340)相互作用[14]。溶解在唾液液相中的gp-340 会在细菌细胞的聚集中发挥作用，净化口腔。 然而，如果gp-340 被吸附在牙齿或牙龈表面，可以作为表面细菌粘结素的受体，引发细菌对牙面的粘附。 AgI/Ⅱ蛋白家族同时参与微生物间的相互作用[15]。

3 密度感应系统

密度感应(quorum sensing，QS)是细菌间进行信号传递的一种特殊机制，在变形链球菌生物膜形成、感受态形成、毒力因子表达等方面起到重要作用。 目前，关于变形链球菌的研究中主要发现了两种系统[16]。 一是双组分信号传导系统(two-component signal transduction system，TCSTS):依赖感受态刺激肽或者非依赖来控制细菌种属内信号交流；二是由LuxS 基因介导，依赖自身诱导分子-2 对不同细菌种属间的信号交流进行控制。 TCSTS 是一种广泛存在于细菌中的蛋白质磷酸化信号传导途径，通过调节细菌的基因表达，使其在遭受环境刺激时调节各种细菌活动[16-17]。 TCSTS 通常由二聚体化跨膜感受器，即组氨酸激酶(histidine kinase，HK)与细胞质反应调节子(response regulator，RR) 组成[18]。 HK 位于质膜，能感应环境刺激；RR 位于细胞质，可调节基因表达来响应环境的刺激。 TCSTS能调节细菌的细胞周期、细菌的多种代谢过程、细菌间的信号交流和毒力因子的表达[19]。

由LuxS 基因调控的依赖自身诱导分子-2 的信号系统对生物膜致病力的各种表型具有重要调控作用，如细菌毒力、生物膜形成能力、耐酸性和抗菌药物敏感性等[20-21]。 LuxS 还具有调节变形链球菌蔗糖依赖性粘附的作用[21]。 以葡萄糖作为碳源时，野生株与LuxS 缺陷株形成的生物膜无明显区别。 以蔗糖作为碳源时，LuxS 缺陷株形成的菌斑生物膜更加粗糙、稀薄，往往形成较大的颗粒和细菌聚集团块，使其对灭菌和消毒药物的抵抗力明显高于野生株。 有研究发现，变形链球菌UAl59 LuxS 缺陷株的耐酸能力整体下降，而抗过氧化氢的氧化能力有所增强[22]。

4 唾液凝集素

唾液凝集素可与口腔中的许多细菌发生作用，而且不同状态的唾液凝集素对细菌的作用也不相同[23]。 固相上的唾液凝集素主要介导细菌的粘附，液相中的唾液凝集素主要介导细菌凝集[24]。有研究表明，不存在唾液凝集素的情况下，突变菌株的生物膜形成率显著降低[25]。 因此，变形链球菌的粘附和生物膜形成的初始阶段可能受到唾液凝集素和其他唾液蛋白质(如高分子量的粘蛋白或富含酸性脯氨酸的蛋白质)的促进。

5 小结

变形链球菌菌株的毒力取决于环境条件，因此细菌中致龋因子对粘附过程与环境中各因素的依赖性为其重要特征。 为形成生物膜结构，不仅要确保适当的环境条件，微生物本身还必须具有能够粘附与形成微菌落的特征。 蔗糖依赖机制与非蔗糖依赖机制阐明了毒力因子在变形链球菌菌斑生物膜初期粘附的重要作用，为变形链球菌菌斑生物膜初期粘附的重要机制。 密度感应系统通过细菌间信号传递调节毒力因子的表达，从而影响变形链球菌菌斑生物膜初期粘附，唾液凝集素作为环境条件促进变形链球菌菌斑生物膜初期粘附。