miRNA 作为阿尔茨海默病早期诊断的生物标志物研究进展

王欢，罗兴梅

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年人最常见的痴呆形式，具有两个神经病理特征：由淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)肽组成的细胞外老年斑和由异常过度tau蛋白磷酸化(Ptau)组成的神经原纤维缠结。为了明确AD的临床诊断，许多研究集中在神经影像学和脑脊液和外周血中分子的生物标志物。其中正电子发射断层扫描(PET-CT)使用碳-11标记的匹兹堡化合物B(11C-PIB)对Aβ成像表明，Aβ沉积是一个缓慢的病理过程，可在二十年的时间内缓慢发生。脑脊液中的Aβ和Ptau水平是临床诊断AD的生物标志物，具有很高的准确性，但通过腰椎穿刺取样脑脊液是侵入性的，需要熟练的训练,且老年人群接受度差。相比之下，血液取样方便简捷，日常可广泛开展。但其特异性及可靠性目前仍缺乏大量循证医学证据。因此AD的外周特异性标记物的检测，特别是在早期或临床前阶段，仍然是一个巨大的挑战。最近的一些研究报告了来自血液中的各种分子，即潜在的血液的AD生物标志物，如蛋白质、脂质和核酸。本文就血液循环中miRNA的最新进展及其在AD的早期鉴定和评估中可能的作用进行综述。

1 AD的诊断

有研究显示2018～2019年全球范围内AD患者人数超过5 500万。随着患病率的增加，与AD相关的社会、经济和情感成本的全球影响是惊人的，人们对更好的AD治疗方式的需求是毋庸置疑的，目前批准上市的药物只是针对症状治疗，而没有干预潜在的疾病发病机制过程，疗效并不令人满意，特别是对于中度以上的痴呆患者。尽管对AD的分子发病机制的理解取得了显著进展，但在十多年的时间里，全球还没有开发出明显有效的临床治疗措施。针对AD的诊断标准，已经有了多项指南，且最新的指南也将脑脊液中的Aβ和Ptau列入了特异性生物标记物的范畴，但由于临床采样困难，AD诊断的敏感性和特异性仍然低于人们所期望的水平。目前已有的临床检查、神经心理测试、影像学检查和实验室评估等方法不足以用于疾病的早期阶段及临床前阶段，无法启动成功的预防或有效的治疗措施。临床上，认知障碍的程度多用简易精神状态检查量表(MMSE)和蒙特利尔认知评估量表(MoCA)以及临床痴呆评分(CDR)问卷等来评估。但实际临床的痴呆分级还要参考其他的因素，如日常生活能力量表(ADL)以及神经精神量表评分(NPI)等等。著名的Braak分级是根据神经纤维缠结(NFT)变性顺序分为6个阶段：Ⅰ横嗅皮层区或皮周皮层区，Ⅱ内嗅皮层，Ⅲ海马区，Ⅳ杏仁核，Ⅴ丘脑、屏状核，Ⅵ主要为运动感觉区、视觉皮层。Ⅰ～Ⅱ过度内嗅区阶段，Ⅲ～Ⅳ边缘区阶段，Ⅴ～Ⅵ新皮层阶段。目前神经影像在AD诊断中也起着关键作用，如单光子发射计算机断层扫描或PET-CT的功能成像，它们都是很好的检测手段，但由于价格昂贵，需要专业的设备，因此也很难普及。脑脊液中Aβ和tau蛋白过度磷酸化水平已被纳入AD诊断中的特异性标志物，然而它们需要一种侵入性的程序来获取脑脊液，很多患者由于年龄过大，腰椎穿刺困难，也难以在临床广泛开展。因此，探讨外周生物标志物，如血液或尿液特异性标志物，将更容易应用于临床早期诊断，也是现在国内外研究热点之一。

2 Ptau与AD

在20世纪初，精神病学家Alzheimer报告一例痴呆症患者的尸检大脑中存在“缠结”的细胞内结构。这些缠结后来被发现是由异常聚集体组成的，被称为淀粉样纤维，即tau蛋白。正常情况下tau蛋白稳定微管的分子轨迹，递质沿着微管在大脑中长的神经元投射中运输。但是当tau过度产生或从微管上脱落时，它们就会堆积起来，形成各种构象的淀粉样纤维，从一个细胞传播到另一个细胞，以未知的机制杀死神经元。一些证据表明，各种与tau相关的痴呆可能是由不同构象的纤维引起的。人类tau由位于17号染色体上的MAPT基因编码，外显子2、3和10的选择性剪接产生6个tau亚型，在N末端(0N，1N或2N)含有多达两个插入片段，在蛋白的C末端含有3个或4个重复序列(3R或4R)，tau的缺失剪接，特别是较长tau异构体形成的增加，可以导致tau蛋白病。tau主要在神经元中表达，是一种主要的微管相关蛋白(microtubule-associated protein，MAP)，参与微管动力学和组织的调节。tau属于大脑中的主要磷酸化蛋白，过度磷酸化的tau在几个丝氨酸和苏氨酸残基上被磷酸化。tau还受到各种其他翻译后修饰，包括O-糖基化、泛素化、甲基化和乙酰化。Lys174位点的tau乙酰化最近被鉴定为AD患者脑中的早期修饰，这减缓了小鼠模型中tau的周转时间并促进了tau聚集。在AD和相关的tau病变中，微管相关蛋白tau高度磷酸化并聚集形成神经原纤维缠结，这是神经退行性疾病的特征。尽管所谓的神经纤维缠结(NFT)的存在很早就被认为是AD患者大脑中主要的蛋白质沉积之一，但直到20世纪60年代，NFT的成对螺旋和直丝才被鉴定为聚集的tau。在AD发展过程中，tau通过介导Aβ诱导的神经退行性三联体起重要作用，低聚或错误折叠的tau可获得毒性活性并杀死神经元。He等通过将人AD-脑源性病理性tau(AD-tau)注射到不过度表达tau的Aβ斑块承载小鼠模型中，概括了3种主要类型AD相关tau病理的形成：围绕Aβ斑块(NP Tau)的营养不良神经突中tau聚集体、AD样NFT和NTS，这些不同的tau病理结构使得AD有不同的临床表现和病程预后。

3 miRNA的发现以及生物学功能

1993年Lee等在新杆状线虫发育实验中发现第一个miRNA lin-4，miRNA是由大约22个核苷酸组成的非编码RNA，广泛分布于真核细胞中。miRNA通过与其3′-非翻译区(3′-UTR)碱基结合来抑制翻译或诱导miRNA降解来调节基因表达。miR在各种细胞过程中的作用已经确定，包括发育、细胞增殖、复制和衰老。miRNA表达谱的变化，对细胞的增殖、分化、凋亡等细胞生物学过程都有很大的影响，据研究报道，人类编码基因中约30%受miRNA调控。miRNA的发生途径在不同的生物体物种和细胞类型中是相似的。初级加工从细胞核开始，合成多个发夹环状结构，称为初级miRNA(PRI-miRNA)转录本。miRNA的二次加工发生在细胞质中，其中前miRNA的发夹环被另一种RNaseIII酶Dicer和其他几种辅助因子进一步消化，如干扰素诱导的双链RNA依赖激活剂和HIV-1tar RNA结合蛋白，并产生(21～25 nt)的成熟miRNA双链。其中一条链被整合到miRNA核蛋白颗粒(miRNP)中诱导沉默复合体(RISCs)，另一条单链被降解。起沉默作用的miRNA可通过与靶基因miRNA3′非编码区进行碱基互补配对，发挥其对靶基因的调控作用。若沉默基因与miRNA3′非编码区碱基可完全互补配对，则靶基因miRNA降解;若两者呈不完全互补配对，则阻断靶基因miRNA的翻译过程。有研究发现，miRNA可存在于由细胞释放的微囊泡中，其与靶细胞受体结合，可影响靶细胞的功能。miRNA还可稳定存在于血浆、血清中，并且容易被检测出，这提示miRNA可能是一种可用于临床诊断或者疾病预后评估的新型无创生物标志物，另外，对miRNA功能的干预也可能是临床治疗的新靶点。

4 miRNA调控Ptau

最近的研究表明，miRNA参与AD的发病，并且miRNA可能在神经发生、神经元成熟和脑发育中发挥重要作用，并可能调节几种神经退行性疾病，包括AD。许多脑富集或脑特异性miRNA已经被鉴定并被证明在能量代谢、突触可塑性和记忆形成的调节中发挥重要作用。在miRNA的电子研究中几个小组已经报道了AD患者或转基因AD模型中的表达谱，并且已知许多miRNA参与Aβ的产生和清除以及tau病变的演变过程。

4.1 miR-125b与Ptau

有研究显示，与健康对照组相比，AD患者不同脑区(Braak阶段Ⅲ～Ⅵ)miR-125b表达显著增加1.6倍。Banzhaf-Strathmann等发现miR-125b是Ptau的生理调节因子，但不影响总tau水平，他们还发现了AD中miR-125b的过度表达，诱导Ptau并损害原代海马神经元的细胞活力。在目前的研究中，Banzhaf-Strathmann等证实了以前的报道，即在AD患者的大脑中miR-125b水平增加，他们在海马内注射miR-125b可诱导Ptau，损害小鼠学习能力，提示miR-125b升高可能参与AD的发病机制。Ma等证明了miR-125b诱导神经元细胞凋亡，miR-125b的升高将促进Ptau，并激活神经元细胞中的CDK5和p35/25，破坏了神经元细胞中磷酸酶和激酶活性的平衡，直接损害了散发性AD患者的学习和记忆。Nagaraj等提供了最近关于miRNA作为AD生物标志物的综述，他们在文献中报告了136个在AD和对照状态之间显著改变的miRNA。在这136个miRNA中，36个被独立验证并在两个或两个以上的文献中报告，其中hsa-miR-125b的报告最多共有6次。这些都表明miR-125b可能是AD进展的一个新的调节因子，可能作为AD治疗的治疗靶点。

4.2 miR-137b与Ptau

有研究表明miR-137是一种大脑富集的miRNA，已被证明与神经退行性疾病相关，是神经元发育和认知功能的调节因子，包括精神分裂症和AD。miR-137已被确定为精神分裂症认知受损亚型和精神分裂症阳性症状的预测因子，并作为AD患者中抗体表达的调节因子。据报道，丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)是神经酰胺从头合成途径中的第一个限速酶。SPT的激活可提高神经酰胺水平，而SPT的抑制可降低神经酰胺水平和神经元细胞死亡，据报道miR-137的缺失会增加SPT，进而增加Aβ水平造成AD的发病。L型钙(Ca)通道(LTCCs)活性的增加与AD的发病机制有关，研究报道MiR-137能增加L型钙(Ca)通道的活性进而影响AD的发病，Yang等发现miR-137在AD小鼠中的表达水平较低，miR-137抑制了Aβ1-42诱导的SH-SY5Y细胞中tau的过度磷酸化,这可能表明miR-137可通过抑制tau的过度磷酸化在AD发病中起调节作用。

4.3 miR-138b与Ptau

miR-138b可调控多种基本生物学过程，包括树突棘形态发生、耐热性获得和胚胎期心脏模式调节。miR-138通过靶向酰基蛋白硫酯酶1(APT1)负调控树突棘形态发生，一种调节突触蛋白质棕榈酰化状态的酶。此外，Siegel等发现，miR-138通过降低SIRT1(一种NAD依赖性组蛋白脱乙酰酶)的表达，作为轴突再生的新型抑制剂发挥作用。Wang等发现miR-138b是大量存在于大脑中的RNA，在AD病人中增加，miR-138b的过度表达，会激活糖原合成酶(GSK-3β)，增加HEK293/tau细胞中的Ptau，目前已经证实维甲酸受体α(RARA)是miR-138的直接靶点，RARA的存在大量地抑制了GSK-3β的活性，减少了由miR-138引起的tau活性，miR-138可通过靶定RARA/GSK-3β通道来促进Ptau。

4.4 miR-98与Ptau

有研究表明，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)在大脑中的重要作用包括其对新陈代谢、神经调节、神经内分泌和认知功能的贡献，IGF-1通过抑制糖原合成酶激酶3，促进Aβ从脑中清除并抑制Ptau，因此增加IGF-1的表达被认为是AD潜在的治疗策略。研究证明了miR-98在体外抑制了IGF-1的翻译，并通过下调IGF-1，使得IGF-1的表达减少，来增加Aβ的形成和tau蛋白的磷酸化。由于miR-98广泛参与突触可塑性、IL-6和IL-10的产生以及细胞凋亡的调控，其他参与Aβ形成和tau蛋白磷酸化调控的分子可能受到miR-98的调控。综上所述，miR-98在体外负向调控IGF-1的翻译并促进Aβ的产生和Ptau。

5 miRNA作为AD诊断的生物标记

衰老是AD和许多其他神经退行性疾病的最大危险因素，在衰老过程中，细胞的变化导致疾病易感性和死亡率的增加，由于miRNA在细胞衰老和衰老过程中发挥的关键作用，它们可能在评估AD的风险中也起着关键作用。有研究发现miRNA在中枢神经系统中大量表达，表现出高度的时空特异性，主要参与神经元的形成、分化和突触可塑性，并可能调节几种神经退行性疾病，包括AD。miRNA是一类天然存在的调节广泛基因表达的短非编码RNA，有研究认为miRNA的失调与一系列疾病有关，包括中枢神经系统疾病，如AD、亨廷顿病和多发性硬化症等。miRNA除了影响Aβ的产生过程外，还参与tau蛋白的磷酸化和去磷酸化，从而导致NFT的形成。miRNA存在于组织中，与mRNA不同，miRNA在包括血清、血浆和CSF在内的生物流体中足够稳定。此外，它们中的许多靶基因直接参与AD病理生理学分子，如Preenilins、BACE-1、APP。因此，循环miRNA有可能成为一类新型的非侵入性和敏感的生物标志物。

5.1 AD中载脂蛋白E及miR-107

AD是一种进行性、年龄依赖性疾病，其特征是Aβ的积累，在载脂蛋白E(ApoE)的帮助下迅速清除。ApoE由位于19号染色体上的ApoE基因编码。载脂蛋白E4对AD的发病机制有多方面的影响，包括脂质和脂蛋白的失调，如载脂蛋白血浆水平，以及降低Aβ清除和葡萄糖代谢，减少神经元信号传导，增强神经炎症和线粒体功能障碍，另外还增加氧化应激。长时间的氧化应激，除了DNA损伤外，还可能引起RNA损伤并影响RNA水平上的表达，包括miRNA的变化，例如hsa-miR-107-5p(miR-107)。miR-107由可溶性Aβ管理，并调节Aβ的产生。

5.2 血清miR-501-3p作为与AD进展相关的潜在生物标志物

Hara等发现，hsa-miR-501-3p在同一捐赠者的AD脑中显著上调。hsa-miR-501-3p在培养细胞中的过表达，模仿了AD大脑中的hsa-miR-501-3p上调，导致了128个基因的显著下调，这些基因过度表达了基因本体论术语、DNA复制和有丝分裂细胞周期，结果表明hsa-miR-501-3p是一种新的血清生物标志物，可能与AD大脑中发生的病理事件相对应。

5.3 血清miRNA可作为AD早期诊断的非侵入性生物标志物

有研究表明，miRNA的循环水平谱有可能作为有价值的生物标志物用于各种疾病的诊断、分期和进展监测。Rui等报告了一种新的9-miRNA(hsa-miR-26a-5p，hsa-miR-181c-3p，hsa-miR-126-5p，hsa-miR-22-3p，hsa-miR-148b-5p，hsa-miR-106b-3p，hsa-miR-6119-5p，hsa-miR-1246和hsa-miR-660-5p)，其可用作检测AD的生物标记物。其研究表明，不同的血清miRNA的异常表达发生在AD的不同阶段。在9个miRNA中，hsa-miR-22-3p具有最好的敏感性(81.8%)和特异性(70.9%)。有研究数据表明，差异表达的血清miRNA可以作为生物标志物来提高AD的诊断，尤其是早期诊断，并对其临床分期进行分类。

6 展望

虽然使用正电子发射断层扫描的脑脊液神经成像和脑脊液中生物标志物的测量已经显示出对AD的极好的诊断准确性，但这些方法的高成本和侵袭性限制了它们的应用。因此，迫切需要可靠的生物标志物来检测AD早期或临床前阶段，以便实施预防性治疗策略。目前没有足够的敏感性和特异性生物标志物可以用于AD的最终诊断，特别是在疾病的早期阶段。血清是一种有吸引力的生物标志物来源，它易于收集，对患者造成的不适最小，在临床试验和频繁测试中具有更大程度的依从性。miRNA在中枢神经系统中大量表达，主要参与神经元的形成、分化和突触可塑性，而且可以释放在外周血中，循环血清miRNA可以为AD的诊断提供一种快速、非侵入性和经济有效的方法。综合各研究报道，部分miRNA可抑制或促进Ptau，干预相应miRNA介导的信号通路途径，以此影响AD致病，并可能成为AD诊断的生物标志物，目前尚需大量临床研究数据对miRNA早期诊断AD的特异性进行论证，这也将是诊断该病潜在的具有广泛前景的研究方向。