阻塞性睡眠呼吸暂停合并肺癌的研究进展

房怡菲， 代丽萍， 欧阳松云

阻塞性睡眠呼吸暂停(obstructive sleep apnea,OSA)的特点是间歇性上气道阻塞导致全身间歇性缺氧。患者临床表现为打鼾、夜间有窒息感或憋醒、睡眠紊乱、白天嗜睡、记忆力下降，严重者出现认知功能下降、行为异常等。OSA在成人中发病率越来越高，大约30%的男性和15%的女性受到其影响。目前普遍认为OSA是一种全身性疾病，是脑血管疾病、心血管疾病、糖尿病和认知功能障碍等疾病的危险因素。本文总结了OSA合并肺癌的细胞及动物模型，并对OSA影响肺癌的机制进行综述。

1 OSA与肺癌相关性的流行病学研究

近年来，有研究发现OSA能够增加癌症的发病率和病死率。美国威斯康辛大型睡眠队列研究进行了22年的随访，结果表明轻度、中度和重度OSA患者的癌症病死率分别是未患癌症组的1.1倍、2.0倍和4.8倍。其中重度OSA患者的癌症病死率达到7.27%，且夜间血氧饱和度低于90%占比越高，OSA合并肿瘤患者病死率亦越高。西班牙的一项队列研究发现低氧血症的严重程度与癌症发病率之间存在剂量依赖关系，9.2%的OSA患者患有肺癌。一项肺癌筛查计划中OSA患病率的前瞻性研究显示，肺癌患者中重度OSA占41.1%，夜间低氧血症使阳性筛查的风险增加一倍以上。另一项前瞻性研究表明，80%的肺癌患者有OSA，大约50%的肺癌患者有中度至重度的OSA，睡眠呼吸暂停和夜间低氧血症在肺癌患者中非常普遍。一项纳入8 261例OSA患者的睡眠队列研究中，轻度、中度和重度OSA组3年肿瘤相关死亡率分别为25%、50%和80%，非重度OSA的Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者的总生存率和无进展生存率均明显高于重度OSA患者，结果表明严重的OSA与Ⅲ～Ⅳ期肺癌患者癌症死亡的风险增加有关。这些调查证实OSA人群的肿瘤发病率和病死率都高于正常人群，其中肺癌的病死率最高，且与OSA的低氧程度及持续时间密切相关。当前已发表的研究中涉及单个癌症亚型的研究较少，因此需要更多研究来阐明OSA与肺癌之间的关系。除队列研究外，间歇性缺氧的细胞和动物模型也能够为相关研究提供生物学基础。

2 OSA合并肺癌的细胞模型

大多数与OSA相关的间歇性缺氧细胞研究中氧饱和度下降的模式并不能像OSA患者那样快速而明显。一些细胞模型中的氧波动比OSA慢，如6次/h，这可能是由于静态组织培养中快速改变氧水平操作难度较大。传统的间歇性缺氧模式为改变培养基上面气体氧浓度。气相和介质之间达到氧平衡需要很长时间，因此无法在细胞水平上实现如OSA患者中看到的快速循环氧气变化的能力。很少有OSA的间歇性快速缺氧模型能够真正达到0.5%～1.5%氧气水平。许多基于OSA细胞的研究使用5%～18%氧气波动水平。在这些浓度下某些蛋白表达水平很低，不能准确反映健康或患病的生理状况。最近的几项研究在建立细胞培养模型方面取得了一些进展，可以实现氧气水平的快速变化。有模型在细胞培养皿底部用超薄材料制成透氧膜，细胞附着在膜上，细胞和细胞周围的介质可以通过膜直接接触到氧气。另一种模型使用两个平行的气体透过性膜，两层膜之间可培养细胞，该模型可以实现非常低的氧水平。一些利用OSA模型的研究已经阐明了间歇性缺氧在促进肿瘤生长和转移方面的作用。将人肺癌细胞系A549和HCl-H522进行间歇性缺氧循环(1%氧气，缺氧5 min，复氧10 min，共循环16 h)，ALKBH5在肺腺癌细胞升高，这与细胞N6-甲基腺苷(N6-methyladeno sine,mA)水平的降低有关，ALKBH5通过下调FOXM1 mRNA上mA的合成和促进FOXM1的表达来影响间歇性缺氧条件下肺腺癌细胞的增殖和侵袭。在肺腺癌细胞中，间歇性低氧(1%氧气，低氧2 h，复氧2 h，3个循环)增加了尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1,NOX1)诱导的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。ROS上调核因子红系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)和抗氧化酶硫氧还蛋白(thioredoxin 1,TRX1)，从而导致了缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的积累。Liu等将人肺癌细胞系A549和NCl-H446放入0.1%氧气的低氧室中培养24 h，然后在常氧条件下培养72 h，20次循环，结果表明间歇性缺氧可促进肺癌细胞增殖扩散，缩短倍增时间，增加其侵袭性。

3 OSA合并肺癌的动物模型

OSA小鼠模型通常被用来模拟OSA在患者体内对肿瘤发展的影响，有几种主要的小鼠模型包括气管切开术、气管内的充气气囊或鼻罩可用于间歇性阻塞气道。这几种方法均为有创操作，实施起来较困难。目前大多数与癌症相关的OSA试验采用的方法是将小鼠或大鼠暴露在密封箱中并控制吸入氧气的水平。小鼠或大鼠夜间暴露在周期性低氧混合气和空气中数周。该模型模拟了OSA动脉血氧饱和度短暂和周期性变化。在过去几年发表的文献中，主要是关于肺癌和黑色素瘤的模型。这些结果证实了间歇性缺氧在肿瘤生长和转移中的重要作用。Almendros等首次表明间歇性缺氧促进了OSA小鼠模型的肿瘤生长，模拟OSA的间歇性缺氧小鼠模型显示肿瘤生长、浸润和转移增强。该模型导致动脉血中反复出现的氧饱和度降低，与中重度OSA患者的多导睡眠图(polysomnography,PSG)中观察到的情况非常相似，血氧饱和度值波动范围从正常值降低到约70%。在接受相同间歇性缺氧方案的小鼠中使用鼠肺上皮肿瘤细胞，观察到肿瘤生长有类似的显著增加。另一项研究将Lewis肺癌细胞成瘤小鼠分为常氧组和间歇性缺氧组，间歇性缺氧组暴露于约(7±0.5)%氧气中，20次/h，8 h/d，共2周。检测HIF-1α、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和转移相关基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)的表达。结果显示间歇性缺氧组肿瘤数目和体积均明显增加，基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)活性增强，VEGF水平明显升高。表明间歇性缺氧增强了肺癌小鼠模型中肿瘤的增殖和迁移特性。VEGF在促进血管生成中起着主导作用，血管的供应及新血管的生成对于机体起着至关重要的稳态作用。将注射人肺腺癌A549细胞的小鼠暴露在间歇性缺氧中，维持最低的氧浓度为5%，交替周期为2 min，6 h/d，连续28 d ，ALKBH5在小鼠皮下肿瘤中升高。模拟严重OSA[最低7.5%氧气，缺氧40 s，常氧80 s，30次/h，SpO最低值为(55.5±4.8)%]的间歇性缺氧可显著增加小鼠肺的自发成瘤率。Campillo等的研究结果显示，在间歇性缺氧条件下(5%氧气，缺氧20 s，复氧40 s，6 h/d，连续1周)，OSA小鼠肺癌模型的肿瘤生长和侵袭增加。为探讨内皮抑素(endostatin,ED)在间歇性缺氧条件下的抗肿瘤效果，将小鼠随机分为4组：对照(control,CTL)组、CTL+ED组、间歇性缺氧组和间歇性缺氧+ED组。间歇性缺氧组和间歇性缺氧+ED组给予间歇性缺氧8 h/d，共5周。间歇性缺氧周期为氮气50 s，静息10 s，氧气10 s，压缩空气50 s。在间歇性缺氧暴露1周后，给每只小鼠注射Lewis肺癌细胞，之后腹腔注射ED。ED治疗可降低血清和组织VEGF水平。该研究表明间歇性缺氧条件下，ED的抗肿瘤作用优于常氧条件下的抗肿瘤作用。

4 OSA影响肺癌的机制

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缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)家族 HIF作为细胞对缺氧反应的关键介质，很可能是间歇性缺氧中改变肿瘤行为的关键驱动因素。HIF调节失调也可能与间歇性缺氧，特别是与OSA有关。在肿瘤中，HIF活性通过常见的肿瘤抑制基因或功能获得突变而增加。这条途径增加了HIF-1α蛋白的合成，即使常氧条件下也能形成HIF-1α。在A549细胞中，急性缺氧时，HIF-1α和缺氧诱导因子-2α(hypoxia-inducible factor-2α,HIF-2α)均被强烈诱导，但在长时间缺氧过程中，HIF-1α水平下降，而HIF-2α水平保持稳定。HIF-1α水平的逐渐降低归因于一个负反馈环，其中HIF-1α的失稳是由HIF-1α特异性反义RNA介导的，该反义RNA的表达被HIF-1α和HIF-2α RNA蛋白转录激活。对高表达烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶亚基NOX1的A549细胞间歇性缺氧中HIF-1α和NRF2的调控和干扰进行研究，发现持续性缺氧仅诱导产生HIF-1α，而间歇性缺氧则诱导HIF-1α和NRF2产生。HIF-1α和HIF-2α均能促进肿瘤生长、进展和转移。不同的HIF-1α敲除倾向于减少肿瘤生长，减少转移和降低肿瘤发病率。

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程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)/程序性死亡配体 1(programmed death-ligand 1,PD-L1) 在OSA患者中，间歇性缺氧通过上调PD-1及PD-L1影响免疫监视。为了检测间歇性缺氧条件下肿瘤PD-L1的表达，将小鼠随机分为常氧组和间歇性缺氧组。间歇性缺氧周期为氮气50 s，维持10 s，氧气10 s，压缩空气50 s，最低氧浓度为(6±1)%，持续5周。在间歇性缺氧暴露1周后每只小鼠注射肺癌细胞，结果显示与常氧组相比，间歇性缺氧组小鼠PD-L1表达增强。间歇性缺氧组肿瘤重量、体积和HIF-1α水平与PD-L1表达密切相关。间歇性缺氧可增强拟OSA小鼠肿瘤PD-L1的表达。在一项多中心观察研究中纳入360例皮肤黑色素瘤患者，检测了血清可溶性程序性死亡配体 1(soluble programmed death ligand 1,sPD-L1)水平，结果显示重度OSA患者sPD-L1水平高于非重度OSA患者及非OSA患者。sPD-L1可能成为预测皮肤黑色素瘤侵袭性的潜在生物标志物。理论上PD-L1表达越高，肿瘤细胞免疫抑制越强，因此PD-L1也被多数试验首选为治疗效果的评估指标。多个针对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的PD-1/PD-L1抑制剂Ⅱ/Ⅲ期研究都发现肿瘤细胞PD-L1高表达患者在无进展生存期(progression-free survival,PFS)、总生存期(overall survival,OS)或客观缓解率(objective response rate,ORR)等方面较低表达患者有优势。PD-1/PD-L1抑制剂可有效延缓肿瘤生长，延长生存期限。由于PD-1/PD-L1抑制剂能够阻断肿瘤细胞与T细胞的结合，使T细胞持续识别并清除肿瘤细胞，间歇性缺氧会促进肿瘤细胞PD-L1的表达，所以推测PD-1/PD-L1抑制剂对间歇性缺氧下肺癌的治疗可能会有明显效应。

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肿瘤微环境 目前的研究已经确定免疫系统，特别是肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)，参与多种癌症发生发展过程。一项小鼠肺上皮细胞1肿瘤模型和细胞培养的研究证实，TAMs的存在不仅与增殖和侵袭的增加有关，而且还表明与间歇性缺氧相关的TAMs极性的改变在体内肿瘤发生中起着重要作用。暴露于间歇性缺氧的小鼠肿瘤中的TAMs显示出从M1抗肿瘤表型向M2b促肿瘤表型的极性转变。在间歇性缺氧条件下，OSA小鼠肺癌模型的肿瘤生长和侵袭增加部分是由环氧化酶-2( cyclooxygenase-2,COX-2)的激活导致TAMs向亲肿瘤M2表型转变。塞来昔布通过抑制间歇性缺氧诱导的TAMs向M2极化来预防间歇性缺氧诱导的不良肿瘤结局。与暴露于常氧的小鼠的肿瘤相比，来自暴露于间歇性缺氧的小鼠的TAMs在增加癌细胞迁移和外渗方面能够显示出更大的效果。

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氧化应激 氧化应激驱动在OSA患者发生恶性肿瘤的过程中发挥重要作用。在OSA患者中发现了DNA氧化和损伤的标志物增加。此外，在睡眠呼吸暂停的炎症背景下可能增加诱导DNA氧化之后的突变概率，从而增加细胞恶性转化的可能性。间歇性缺氧暴露的小鼠增加了血循环中循环DNA(circulating DNA,circDNA)的脱落，这种循环携带表观遗传修饰。这些修饰可能是肿瘤内细胞群的特征，也是肿瘤侵袭行为增加的基础。有研究表明氧化应激可导致ROS生成增多，而增多的ROS通过激活蛋白激酶 B进而促进肿瘤细胞的转移。在氧化应激对肺癌细胞凋亡的影响中发现，氧化应激能够促进细胞的凋亡、增高细胞内Ca浓度，从而启动肺癌细胞的凋亡信号通路，参与肺癌发生与发展的全过程。氧化应激是肺癌的重要致病因素，但关于氧化应激的不同水平对肺癌严重程度的影响仍有待进一步的研究。

5 结语

目前文献中关于间歇性缺氧如何影响动物和细胞模型中癌症进展的大部分数据集中在模拟肿瘤生长过程中氧的变化，鉴于间歇性缺氧引发的一些分子机制可能取决于暴露于间歇性缺氧的频率，需要建立模拟真实OSA患者的实验模型。间歇性缺氧下HIF、PD-1/PD-L1、肿瘤微环境及氧化应激等因素会进一步促进肺癌的恶性病变。然而PD-1/PD-L1抑制剂对OSA合并肺癌患者的治疗效果尚不清楚，需要进行细胞、动物及患者三个水平进一步实验探索。积极针对间歇性缺氧相关机制的治疗方案对降低肺癌发病率和病死率，改善预后，提高肺癌患者生活质量具有重要意义。