淋巴管肌瘤病生物标志物研究新进展

杨晟楠， 魏风芹， 刘培培， 代华平

淋巴管肌瘤病(lymphangioleiomyomatosis,LAM)是一种罕见的缓慢进展性肿瘤性疾病，其特征是囊性肺破坏、乳糜胸/腹、肾血管肌脂瘤(angiomyolipoma,AML)等肺外表现和淋巴管肌瘤。该病好发于育龄期女性，发病率为0.34/10万～0.78/10万，女性确诊时的平均年龄为(41.00±0.65)岁。LAM早期症状轻微，肺部进行性囊性破坏可导致劳累性呼吸困难和复发性气胸。该病进展缓慢，确诊患者的中位生存期超过20年，晚期的LAM患者常因严重的低氧血症而死亡。临床上存在两种形式的LAM：散发型LAM(sporadic lymphangioleiomyomatosis,S-LAM)和结节性硬化症相关的LAM(tuberous sclerosis complex-associated lymphangioleiomyomatosis,TSC-LAM)。结节性硬化症(tuberous sclerosis complex,TSC)是常染色体显性遗传多系统肿瘤性疾病，在成年女性TSC患者中可以检测到LAM的高患病率。LAM的发病机制尚不十分清楚，目前认为可能与TSC基因突变导致的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路过度激活有关。当前指南推荐的治疗药物包括西罗莫司和依维莫司，尽管这两种药物在治疗期间能够稳定患者的肺功能并改善整体生活质量，但停止治疗后疾病仍会持续进展，肺移植仍是终末期LAM患者的最佳选择。目前血管内皮生长因子-D(vascular endothelial growth factor-D,VEGF-D)是指南推荐的唯一可用于诊断的生物标志物，未来关于预测疾病进展和评价治疗效果的生物标志物的鉴定，对进一步实现LAM的早诊断、早评估、早干预具有重要意义。根据生物标志物的功能，在临床应用中可分为：(1)疾病易感性标志物；(2)诊断性标志物；(3)预测性标志物；(4)治疗反应性标志物；(5)预后性标志物。诊断性生物标志物被定义为检测疾病的存在或识别具有该疾病亚型的个体特征。LAM的诊断需结合临床症状，肺部/腹部高分辨率计算机断层扫描(high-resolution computed tomography,HRCT)和(或)肺活检病理及免疫组化结果，目前指南推荐使用的仅为诊断性生物标志物VEGF-D。疾病易感性生物标志物的鉴定有利于筛查高风险人群，预测性标志物可以判断疾病活动程度。随着越来越多的药物用于LAM治疗，因此有必要利用一些反应参数来进行监测评估。预后性生物标志物被定义为独立于治疗的，可提供患者整体结局和复发风险的信息特征。生物标志物具有巨大价值，因此亟需寻求非侵入性、便捷安全、重复性好且敏感性/特异性高的LAM生物标志物。本文按照生物标志物的类型综述了近年LAM生物标志物方面的研究进展。

1 蛋白质类

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VEGF-D 血管内皮生长因子是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成的作用。它是血管内皮生长因子家族中的一员，主要在肿瘤组织的新生血管和新生淋巴管的形成过程中起作用。在Young等的一项前瞻性研究中发现，与其他类型的囊性肺疾病(包括Birt-Hogg-Dube和朗格汉斯组织细胞增生症)患者相比，LAM患者的血清VEGF-D水平明显升高。该研究还发现，对于HRCT提示具有肺囊性病变的患者，血清VEGF-D值>800 pg/ml时，LAM诊断的敏感度为73%，特异度为100%。美国胸科协会(American Thoracic Society，ATS)联合日本呼吸学会(Japanese Respiratory Society，JRS)在2016年及2017年相继发表了LAM诊断和管理临床指南及补充性指南建议，若患者胸部HRCT有LAM特征性改变，且血清VEGF-D≥800 pg/ml，可以确诊LAM，无需进行肺活检。虽然指南明确指出VEGF-D可以作为确诊的依据，但该检测指标尚未在亚洲人群中进行充分验证。为此，Hirose等进行了一项临床对照试验，检测了108例LAM患者、14例疾病对照者和51名日本健康志愿者的血清VEGF-D水平。结果表明，基线血清VEGF-D水平可以有效将LAM患者与健康志愿者区别开，在700 pg/ml和800 pg/ml时，VEGF-D的诊断敏感度和特异度分别为80%和97%以及72%和100%。该研究令人满意的诊断效力支持了ATS/JRS的LAM指南在亚洲人群中的应用。血清VEGF-D除了作为LAM的诊断性生物标志物，还可以用来评价治疗效果以及预测疾病进展。在一项具有里程碑意义的研究中，与安慰剂组相比，接受mTOR通路抑制剂西罗莫司治疗12个月后血清VEGF-D水平明显降低[(1848±1514)pg/ml vs (862±540)pg/ml]。Taveira-DaSilva等的研究结果也支持同样的观点。在预测疾病进展方面，Gupta等研究显示血清VEGF-D水平>600 pg/ml的LAM患者，其疾病进展速度更快，但同时也有着更好的治疗反应性。此外，血清VEGF-D水平还可以作为LAM患者肺功能下降的独立预测因素。尽管如此，VEGF-D在LAM患者中的上调机制尚不清楚，仍有待进一步研究来阐明。

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维生素D结合蛋白(vitamin D binding protein,VDBP) VDBP是由肝脏、肾脏、脂肪组织和中性粒细胞产生的一种糖基化α球蛋白，由第四号染色体上的GC基因编码，分为AA、AC和CC三种基因类型。其具有多种生物学功能：结合和运输维生素D及其代谢物，参与肌动蛋白清除，可增强促炎反应并清除组织损伤产物，并具有免疫调节特性。研究者利用质谱蛋白质组学的方法发现，与对照组相比，VDBP是LAM患者中下调最显著的血清蛋白(logFC=2.6)。与LAM稳定期相比，疾病进展期血清VDBP水平进一步降低，并且与一氧化碳弥散量(diffusing capacity of lung for carbon monoxide,DLCO)下降显著相关。基因分型研究表明，与AA和AC基因型相比，CC基因型的LAM患者死亡时间/移植时间出现更早(150个月 vs 104个月)，并且CC基因型的VDBP水平更低。这表明VDBP与疾病的严重程度和预后相关，CC基因型可以帮助预测LAM的无移植生存期。

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血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE) 经典的肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system,RAS)与体循环动脉压调节相关，RAS也存在于不同类型的肿瘤中，可以增强肿瘤细胞的存活、增殖和转移。一项纳入了426例LAM患者的回顾性研究表明，33.2%的患者血清ACE水平高于正常值，并且血清ACE水平与患者的肺功能呈负相关。接受血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)治疗的患者，全部肺功能指标(除一秒率外)的下降速度明显低于未接受治疗的患者。其原因可能是血管紧张素Ⅱ可以通过血管紧张素Ⅱ1型受体(AngⅡ type 1 receptor,AT1R)诱导VEGF-D的合成，ACEI通过影响VEGF-D的合成，进而影响血管和淋巴管的生成，从而抑制LAM细胞的增殖和转移，起到改善肺功能的作用。由此可见，血清ACE水平有可能成为LAM诊断、预测病情进展以及评价治疗效果的新型生物标志物。

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癌胚抗原125(carcinoembryonic antigen-125,CA-125) CA-125是一种在多个器官内膜上皮细胞表达的跨膜糖蛋白，尤其在卵巢癌中高表达。既往研究提示CA-125可能是心包、腹膜或胸膜受刺激的生物标志物。在一项对241例LAM患者的研究中，约有25%的患者至少有一次血清CA-125升高，并且免疫组化显示CA-125在LAM结节中表达，较高的CA-125水平与胸腔积液和肺功能下降有关，血清CA-125水平升高可能提示LAM患者浆膜受累。因此，CA-125有可能成为预测LAM患者疾病活动程度的潜在生物标志物。

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血管内皮生长因子受体和趋化因子 对于临床试验设计而言，重要的是要确定与LAM相关的早期的生物标志物。一项回顾性研究表明，使用西罗莫司联合羟氯喹治疗LAM患者的过程中，分析最早的治疗时间点显示，趋化因子CCL18变化最为显著，较基线值下降了48.6%，使其有可能成为评价治疗效果的早期生物标志物。该研究还显示，在整个治疗过程中，血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor 3,VEGFR3)和趋化因子CCL21与肺功能下降的相关性最为显著。VEGFR3在LAM细胞表面表达，与淋巴管内皮的生物学活性有关，可以用来预测肺功能的下降趋势。CCL21是淋巴管内皮细胞分泌的趋化因子，主要在免疫耐受中起重要作用，在LAM发病机理中的作用还需进一步研究。

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涎液化糖链抗原(Krebs von den Lungen-6,KL-6)KL-6是一种高分子量黏液糖蛋白，主要由受损或再生的Ⅱ型肺泡上皮细胞表达，对肺成纤维细胞具有促纤维化和抗凋亡作用。多项研究表明，在多种间质性肺疾病中血清KL-6浓度升高，因此推断KL-6可以作为这些间质性肺病的诊断性生物标志物。在最近的研究中，比较了LAM患者与健康对照者的血清KL-6浓度，结果显示LAM患者的血清KL-6浓度明显高于对照组(

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=0.013)。ROC曲线法分析显示，LAM患者血清KL-6的AUC值为81%(95%

CI

：61%～100%)，LAM患者血清KL-6的最佳临界值为250.0 U/ml(敏感度为70%，特异度为87.5%)。这表明KL-6有可能成为LAM的诊断性生物标志物。

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内皮抑素 尽管前面的研究已经描述了一些关于LAM的生物标志物，但是尚没有一种标志物可以用来区分TSC-LAM和S-LAM。Lamattina等研究表明，与S-LAM相比，TSC-LAM患者的血清内皮抑素水平显著升高，并且内皮抑素水平与DLCO下降呈相关性。最近研究人员首次利用单细胞转录组学方法鉴定和表征人肺组织中的LAM细胞，筛选出新的潜在血清生物标志物，包括胶原蛋白XVIIIα1(Col18α1)和人胰岛素样生长因子结合蛋白4(insulin-like growth factor-binding protein 4,IGFBP-4)，它们在TSC-LAM患者的血清中升高。内皮抑素是Col18α1的裂解产物，是一种体内外血管生成的有效抑制剂，可能使血管生成偏向淋巴谱系。出现上述现象的确切原因尚不清楚，需要进一步的研究来验证内皮抑素在LAM发病机制中的作用。

2 脂质

大多数血浆代谢物的测定具有变异率低、可重复性高以及在个体中可稳定重现的优点，所以代谢或代谢组学产生的小分子代谢产物的高通量鉴定和定量化越来越多地用于评估代谢变化及其与人类疾病的关系。Priolo等对14例LAM患者和9名健康女性对照者进行脂质组学分析，结果显示LAM患者血浆中131种复杂脂质物质中有18种具有统计学意义。其中有15种脂类水平升高，包括4种溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)。LPC是磷酸胆碱(phosphatidylcholine,PC)通过磷脂酶A(phospholipase A,PLA)活化产生的生物活性脂质，通过分析TSC/LAM的体外临床前模型，发现LPC在TSC2缺陷型细胞中大量聚集。Li等通过激光捕获显微切割术收集LAM结节细胞和非LAM细胞(包括肺癌/肿瘤)，比较两者中磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)家族成员的转录水平，结果显示与非LAM肺相比，LAM结节细胞中的两个PLA2转录本PLA2G16和PLA2G4C增长了两倍(

P

<0.05)。另有研究表明血浆脂质水平不受年龄、体重指数和相对脂肪量的影响，且在1～2年的随访中保持相对稳定。因此，血浆LPC和PLA2具有成为LAM诊断性生物标志物的潜力。最新的研究发现LAM患者脂质代谢发生明显改变，其血浆中的鞘脂、脂肪酸和磷脂代谢产物与第1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second,FEV)的下降速率相关。疾病负担评分较高者的脂肪酸、磷脂和溶血磷脂均异常。这提示脂类物质有可能成为评价疾病严重程度的标志物。目前关于LAM血浆脂质组的研究还不多，有待进一步研究来确定脂质作为LAM生物标志物的潜力。

3 核酸类

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无细胞循环DNA(cell-free DNA，cfDNA) 高通量测序技术测序(next generation sequencing,NGS)，也称为二代测序，以其快速、信息全面等优势得以广泛应用。cfDNA的NGS已成为最近用于鉴定肿瘤细胞的有前景的技术。最近的一项研究从23例LAM患者和7名健康对照者中获取血液样本分析了cfDNA和基因组DNA(gDNA)。结果显示，cfDNA突变等位基因频率与gDNA显著不同，在LAM患者可观察到cfDNA不同的体细胞突变谱，其中RAD50和BRCA2与受试者表型具有最强的相关性。该研究发现了潜在的LAM驱动基因，即RAD50和BRCA2，为关键分子标志物的临床应用提供了重要信息，可用于未来的精准诊断和治疗。

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微小RNA(micro RNA,miRNA) miRNA是一种小的非编码调节分子，通过与靶mRNA特异性结合，降解mRNA或者干扰其翻译过程来调节许多重要的生物过程。miRNA作为肿瘤和其他疾病的候选生物标志物已被广泛研究。Trindade等从TSC2缺陷患者的AML细胞中筛选了946个miRNA进行分析，确定了18个上调的miRNA和8个下调的miRNA，其中包括miR-21。随后的小鼠模型证实，miR-21在TSC2缺陷细胞中显著升高，通过抑制miR-21的调控作用可以限制体内TSC2缺陷型肿瘤的生长。因此，循环miRNA是诊断LAM的非常有前景的候选生物标志物。Trelinska等对10例TSC患者以及10名性别和年龄匹配的健康人进行了血清miRNA分析，结果发现TSC是一种血清miRNA水平显著改变的疾病，依维莫司治疗3个月降低了TSC依赖的miR-142和miR-136水平。这种与TSC相关的miR-142和miR-136血清miRNA谱变化的可逆模式表明，血清miRNA水平也可以用作评价治疗效果的生物标志物。

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肿瘤DNA 单细胞测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)技术可以对单个细胞中存在的转录本进行非靶向定量，从而识别新的细胞类型并定义为稀有细胞群体，引起研究者极大的兴趣。最近完成的一项研究中，Guo等对LAM患者的肺组织和子宫组织进行scRNA-seq，鉴定出独特的间充质细胞群，命名为LAM细胞。这些细胞不仅表达已知LAM标记的特征基因，包括PMEL、FIGF、CTSK和MLANA，还表达许多更具选择性的标记基因，如HOXD11、HOXA11、VGLL2、SLC35F1。该研究团队还鉴定出LAM特征基因编码的分泌组蛋白，其中11种仅在LAM患者肺中发现。功能富集分析表明，其中9个与女性生殖道肿瘤发生有关(PMEL、IGSF21、C10orf90、NELL2、GOLM1、CPA6、PRLR、MMP11、CHI3LI)，6个与子宫癌相关(C10orf90、NELL2、GOLM1、CPA6、PRLR、MMP11)。该研究鉴定出的新的标记基因及其转录的生物标志物可能用于高风险人群的筛选。

4 小结

尽管对LAM的诊断和治疗方面已经取得了显著进展，但还缺乏更深入探索，VEGF-D作为指南推荐的生物标志物在诊断和评价方面仍存在一定局限性，而最近的一些研究发现VDBP、CCL8、CA-125等可能在LAM的诊断、评价预后和治疗方面发挥作用，成为潜在的生物标志物，未来需要更多的研究来证实它们的效用(见表1)。与单个生物标志物相比，组合不同的生物标志物可能对疾病作出更全面的评价，提高诊断和预后的准确性，并有助于临床干预试验的设计。未来还需要研究更多关于疾病进展或评价治疗效果的生物标志物，以进一步实现针对LAM患者个性化的治疗。

表1 潜在的LAM生物标志物类型及其证据强度

名 称易感性标志物诊断性标志物预测性标志物治疗反应性标志物预后性标志物VEGF-D++/-+/-VDBP+/-+/-KL-6+/-CA-125+/-ACE+/-+/-+/-内皮抑素+/-VEGFR3和CCL21+/-+/-脂质+/-+/-miRNA+/-+/-RAD50和BRCA2(基因)+/-scRNA-seq标记基因+/-

注：+：支持某物质成为潜在标志物的证据较一致或有力；+/-：支持某物质成为潜在标志物的证据有争议或不够充分；空白：目前无相关证据