丹皮酚肟衍生物的设计、合成及抗血小板聚集活性

戴卫国，谭鸿舟，顾宏霞，何 冰，何黎琴*，黄 鹏

（1安徽中医药大学药学院，合肥 230012；2皖西卫生职业学院，六安 237005）

血栓栓塞引发的心脑血管疾病具有较高的发病率和病死率，是一类严重危害人类健康和生命的疾病。血小板聚集对血栓的形成起着关键的作用，抑制血小板聚集对血栓栓塞性疾病的防治具有重要意义。目前，临床使用的抗血小板药物仍存在抗血小板聚集疗效不佳或增加出血风险等问题，进一步寻找高效、不良反应小的新型抗血小板药物依然任重道远。

丹皮酚是传统中药牡丹根皮的主要有效成分之一，具有广泛的药理活性，如抗炎、抗血小板聚集、抗菌、抗氧化、抗肿瘤等［1-5］。近年来，丹皮酚在降血脂、抗血小板聚集等方面的研究备受关注［6-9］。研究发现，丹皮酚具有易挥发、水溶性差及易代谢等方面的不足，因此其临床应用受到一定的限制。对药用活性成分进行结构修饰和改造，是创制新药的有效途径之一。本课题组前期研究表明，对丹皮酚2-位羟基和1-位酮羰基进行结构修饰和优化能够得到具有较高稳定性、较好水溶性及较强抗血小板聚集活性的衍生物［10-12］。文献报道，肟或肟醚类衍生物具有广泛的生物活性，部分肟醚类衍生物具有良好的抗血小板聚集作用［13-14］，如临床药物利多格雷等［15］。本课题组也曾以丹皮酚结构中的酮羰基为修饰位点，与盐酸羟胺反应得到丹皮酚肟类化合物，结果发现丹皮酚酮羰基肟化有助于提高化合物的抗血小板聚集作用，且其抗血小板聚集活性强于丹皮酚肟醚类化合物［16-17］。

为获得更多结构新颖且具有良好抗血小板聚集作用的丹皮酚肟衍生物，本研究以丹皮酚为先导化合物，将其2-位酚羟基通过不同碳数的连接臂与有机胺片段偶联，再对其1-位羰基进行肟化得到25个目标化合物。采用Bron比浊法分别测试目标化合物对二磷酸腺苷（ADP）和胶原诱导的血小板聚集的抑制作用。在此基础上，对具有高抗血小板聚集活性的化合物进行水溶性测试和类药性分析，期望得到具有更强的抗血小板聚集活性和成药性的候选药物。

1 材 料

1.1 试 剂

丹皮酚、1，2-二溴乙烷、1，3-二溴丙烷、1，4-二溴丁烷、1，5-二溴戊烷、1，6-二溴己烷、吗啉、哌啶、甲基哌嗪、乙基哌嗪、羟乙基哌嗪（上海麦克林生化科技有限公司）；乙腈（江苏强盛功能化学股份有限公司）；盐酸羟胺（上海化学试剂有限公司）；氢氧化钠（NaOH）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、吡啶，无水硫酸钠、乙醇、甲醇、二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯、石油醚（国药集团化学试剂有限公司）。所用试剂均为分析纯。

1.2 仪 器

WRS-1B 数字熔点仪（上海索光光电技术有限公司）；LCQ Advantage Max 液质联用质谱仪（美国Finnigan 公司）；Nicolet Avatar 370 DTGS 型红外光谱仪（美国ThermElectron 公司）；AV400 和AV600型核磁共振仪（德国Bruker 公司）；薄层硅胶G 板（100 mm × 100 mm，合肥森瑞有限公司）；ZF-7 型暗箱线分析三用紫外仪（上海嘉鹏科技有限公司）；ML104 电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.3 动 物

家兔 2 只，雄性，体重分别为 2.5 和 2.2 kg，由安徽医科大学动物实验中心提供，合格证号：SCXK（苏）2019-0005，所有动物实验符合动物伦理委员会标准。

2 方法与结果

2.1 合成部分

以丹皮酚（1）为原料，通过Williamson合成法在碱性条件下利用2-位羟基与二溴烷烃Br-（CH2）n-Br进行反应，得到中间体丹皮酚溴代烷基醚（2）；化合物2与不同的有机胺反应得到丹皮酚氨基醇醚衍生物（3）；再利用化合物3中的羰基与盐酸羟胺进行加成消去反应，得到目标化合物（4）。化合物的结构及合成路线见路线1。

2.1.1 丹皮酚溴代烷基醚（2）的合成通法[11]将丹皮酚（1.66 g，0.01 mol）、NaOH（2.4 g，0.06 mol），DMF 10 mL 置于 50 mL 圆底烧瓶中，室温搅拌20 min。再加入相应的二溴烷烃（0.03 mol），室温搅拌反应，TLC 跟踪反应进程。反应完毕，将反应液缓慢倒入冰水200 mL 中，二氯甲烷（DCM）萃取（100 mL × 3）。有机相用饱和 NaCl 溶液洗涤（100 mL × 1），无水硫酸钠（Na2SO4）干燥。过滤，浓缩，柱色谱分离（乙酸乙酯-石油醚，1∶15），得白色固体2a~2e。

Scheme 1 Synthetic routes of target compounds 4a-4yReagents and conditions: i: NaOH, DMF, 25 °C; ii: Morpholine, Piperidine, N-methyl piperazine, N-ethyl piperazine, N-(2-hydroxyethyl) piperazine,MeCN,50 °C;iii:NH2OH·HCl,EtOH,pyridine,60 °C

2.1.2 中间体丹皮酚氨基醇醚3a ~ 3y的合成通法[11]称取丹皮酚溴代烷基醚（3 mmol）于50 mL圆底烧瓶中，加入乙腈10 mL 溶解，滴加相应的有机胺（9 mmol），50 ℃搅拌反应，TLC 监测反应进程。反应完全，停止反应。冷却至室温后将其倒入水50 mL 中，用乙酸乙酯萃取（50 mL × 3），再将乙酸乙酯层用饱和氯化钠溶液150 mL 洗涤1 次，无水硫酸钠（Na2SO4）干燥。过滤，浓缩，柱色谱分离（甲醇-二氯甲烷，1∶80），得淡黄色油状物3a ~3y，收率、高分辨质谱数据列于表1。

2.1.3 目标化合物4a ~ 4y的合成通法[16]称取中间体1 mmol 置于50 mL 圆底烧瓶中，加入无水乙醇3 mL，60 ℃下搅拌使之充分溶解。滴加含2 mmol盐酸羟胺的吡啶液2.5 mL，60 ℃搅拌反应，TLC 监测反应进程。反应完毕，减压蒸馏除去溶剂，柱色谱分离（甲醇-二氯甲烷，1∶80），得白色固体化合物4。目标化合物4a~4y的收率、熔点、高分辨质谱及核磁共振氢谱数据列于表2。

Table 1 Yield and HRMS of compounds 3a-3y

Table 2 Yield,melting,HRMS and 1H NMR of compounds 4a-4y

（Continued）

2.2 体外抗血小板聚集活性实验[11]

取家兔2 只，利多卡因局部麻醉，手术分离颈总动脉取血，加9 倍体积3.8%枸橼酸钠抗凝，以500 r/min 离心10 min，制备富血小板血浆（PRP），剩余部分再以3 000 r/min离心，制备贫血小板血浆（PPP），按比浊法进行血小板聚集实验. 测定管中加入PRP 240 µL、不同浓度受试药物30 µL，37 ℃温孵5 min，分别以ADP 或胶原30 µL（ADP 终浓度为25 µmol/L、胶原终浓度为10 µg/mL）为诱导剂，观察记录5 min内最大聚集率。以DMSO作空白对照，丹皮酚和阿司匹林作阳性对照，计算目标化合物对ADP 和胶原诱导的血小板聚集的抑制率，并根据线性回归方程计算出化合物的半数抑制浓度IC50。首先测试了试药质量浓度在100µg/mL 时对ADP 或胶原诱导的血小板聚集的抑制率，选择抗血小板聚集活性高于阿司匹林的目标化合物进行IC50测算，结果如表3~表4所示。

从表3~表4 可以看出，所合成丹皮酚肟类衍生物均可不同程度地抑制ADP、胶原诱导的血小板聚集，但其作用强度各不相同。化合物对ADP诱导的血小板聚集具有更强的抑制作用，部分化合物如4h，4j，4k，4s，4u和4x的IC50达到较低微摩尔浓度，其抑制活性远强于阳性对照药阿司匹林；化合物抑制胶原诱导的血小板聚集作用相对较弱，抑制作用最强的化合物为4r，其IC50为5.18µmol/L，其次为化合物4e，4h和4j，IC50分别为15.44，21.25和15.84 µmol/L。其中，化合物4h，4j对ADP 诱导的血小板聚集抑制作用（IC50分别为9.52，2.87µmol/L）是阿司匹林（IC50= 890 µmol/L）的93.5 和310 倍，是丹皮酚（IC50=1.34 mmol/L）的141 和467倍；对胶原诱导的血小板聚集抑制作用（IC50分别为 21.3，15.8 µmol/L）是阿司匹林（IC50为 90.4µmol/L）的 4.2 和 5.7 倍，是丹皮酚（IC50= 360µmol/L）的17.0和22.7倍。

Table 3 Inhibitory activity of target compounds 4a-4y(100µg/mL)on adenosine diphosphate(ADP)/collagen-induced platelet aggregation in vitro

Table 4 IC50 of some target compounds against platelet aggregation in vitro

2.3 活性化合物4h，4j水溶性测试[18]

参照文献［18］方法，精密称取化合物4h和4j用甲醇定容至 100 mL，分别移取 0.5，1，1.5，2，2.5 mL，定容至10 mL 中。平行测其吸收度3 次，计算线性回归方程。取适量过量的化合物4h和4j加入一定量水中，37 ℃恒温摇床72 h，离心取上清液，紫外分光光度法检测其含量，计算出溶解度。测试结果表明，化合物4j在水中的溶解度为0.87 mg/mL，而化合物4h具有较高的水溶性，在水中的溶解度为2.08 mg/mL。

2.4 活性化合物4h，4j类药性分析

根据Lipinski 规则，对活性化合物4h，4j进行了类药性分析，结果如表5所示。

Table 5 Drug-likeness correlation analysis of compound 4h and 4j

3 讨 论

本研究以丹皮酚为先导化合物，先对其2-位羟基进行成醚修饰，再引入有机胺片段，最后对其1-位羰基进行肟化得到25个目标化合物，并对其合成工艺进行优化，最佳的反应条件为：采用Williamson合成法，以NaOH固体为缚酸剂，DMF为反应溶剂，n（丹皮酚）∶n（二溴烷烃）∶n（NaOH）=1∶3∶6，20 ~25 ℃下反应，所得中间体2a~2e的收率最高；以反应物有机胺自身作为缚酸剂，乙腈作为反应溶剂，50℃下反应中间体3a ~ 3y的合成收率最高；以吡啶作为缚酸剂，无水乙醇为反应溶剂，n（3a~3y）∶n（盐酸羟胺）=1∶2，60 ℃下反应，目标化合物4a ~4y的收率最佳。所合成的目标化合物均经HRMS、1H NMR进行了结构确证。

抗血小板聚集活性研究表明，设计合成的目标化合物均具有一定的抗血小板聚集活性，部分化合物的活性优于阳性对照，其中目标化合物4h，4j，4k，4s，4u和4x对 ADP 诱导的血小板聚集显示出强的抑制作用，其IC50远优于丹皮酚和阳性对照药阿司匹林；目标化合物4d，4e，4h，4j，4o和4r对胶原诱导的血小板聚集表现出较强的抑制活性，优于丹皮酚和阳性对照药阿司匹林。

初步的构效关系分析显示，在丹皮酚2-位羟基通过不同碳数的连接链引入不同的氨基片段，所得目标化合物对ADP 和胶原诱导的血小板聚集的抑制作用影响各不相同。比如有机胺为吗啉时，所得目标化合物4a~4e对ADP 诱导的血小板聚集抑制作用不强，连接臂长短对其抗血小板聚集活性影响不大；与之相反，连接臂碳数为5 和6的目标化合物对胶原诱导的血小板聚集有着显著的抑制作用，如化合物4d（IC50为28.0 µmol/L），化合物4e（IC50为15.4 µmol/L）。有机胺为羟乙基哌嗪时，所得目标化合物4u~4y对ADP 诱导的血小板聚集均具有较强的抑制作用，IC50为3.50 ~65.5 µmol/L，但对胶原诱导的血小板聚集聚集影响不大；有机胺为甲基哌嗪时，连接臂碳数为2 的化合物4k对ADP诱导的血小板聚集表现出最强的抑制作用，IC50达1.8µmol/L；而连接臂碳数为6 的化合物4o对胶原诱导的血小板聚集有着较强的抑制作用。有机胺为乙基哌嗪时，连接臂碳数为4的化合物4r 对胶原诱导的血小板聚集抑制作用最强，IC50为5.18 µmol/L；连接臂碳数为 5 的化合物4s对ADP 诱导的血小板聚集抑制作用最强，IC50为4.78µmol/L。有机胺为哌啶，连接臂碳数为4 和6的化合物4h和4j，对两种诱导剂诱导的血小板聚集均具有强的抑制作用。对活性化合物4h 和4j的水溶性测试和类药性分析表明，化合物4h具有良好的水溶性，且为类药性化合物，值得进一步研究。