液相色谱-质谱联用鉴定抗菌肽Cbf-14凝胶的有关物质

霍怡彤，徐柯卉，陆宇婷，马菱蔓，周长林，杭太俊，宋 敏*

（1中国药科大学药学院，南京 211198；2中国药科大学生命科学与技术学院，南京 211198）

随着抗生素的滥用，病原菌进化速度加快，多重耐药菌大量出现。近年来，抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）被认为是现有抗生素最有潜力的替代品，与传统抗生素相比，AMPs 具有相对分子质量小、抗菌机制广、热稳定性好、毒性低等优点。由于其独特的抗菌机制和多样的生物活性，AMPs的研究和应用已成为生物制药领域的热点［1-2］。

Cbf-14 是一种由14 个氨基酸组成的阳离子抗菌肽，是根据天然抗菌肽cathelicidin-BF（BF-30）的序列利用生物信息学设计获得的多肽突变体［3-5］。其氨基酸序列为Arg-Leu-Leu-Arg-Lys-Phe-Phe-Arg-Lys-Leu-Lys-Lys-Ser-Val（RLLRKFFRKLKKSV），相对分子质量为1 819.33，等电点为12.31。Cbf-14具有抵抗耐药病原菌感染的作用，还可用于治疗真菌感染［5-6］。获得批准的专利制剂Cbf-14凝胶用于术后创面的护理及皮肤消毒处理，具有优异的杀菌活性，且无毒、无刺激。多肽药物的稳定性一直是备受关注的问题，其中的有关物质可能产生不良反应甚至毒性，因此Cbf-14 凝胶整个生产过程中的杂质谱研究至关重要［7-10］。

本研究采用液相色谱-高分辨率质谱（LCHRMS）联用技术，分离和鉴定Cbf-14 凝胶中的肽类有关物质，共鉴定出5个制剂生产工艺杂质和19个强制降解产物，以上24个杂质均未见文献报道。结合母离子及碎片离子的相对分子质量和元素组成分析，本研究阐明了以上杂质的来源和形成机制，为Cbf-14 凝胶中的有关物质检查和质量控制提供了参考依据。

1 材 料

1.1 药品与试剂

抗菌肽Cbf-14醋酸冻干粉（纯度≥99%，南京金斯瑞生物科技有限公司，批号：C660QFK300-1/20110501-DG01），甘油、甲基纤维素（上海阿拉丁试剂有限公司）；甲酸铵、甲酸（AR 级，南京化学试剂有限公司）；乙腈（HPLC 级，德国默克公司）；去离子水（市售娃哈哈纯净水）。

1.2 仪 器

岛津LCMS-9030四极杆飞行时间质谱仪、Lab-Solutions 数据处理系统（日本岛津公司）；BS21S 分析天平（德国Sartorius公司）。

2 方 法

2.1 液相色谱条件

Agilent Zorbax SB-Phenyl 色谱柱（150 mm ×4.6 mm，3.5 µm）；流动相A 相为20 mmol/L 甲酸铵缓冲溶液（用甲酸调节pH至3.0），B相为乙腈，线性梯度洗脱（A∶B）：0 min（95∶5）→30 min（80∶20）→50 min（40∶60）→52 min（95∶5）→60 min（95∶5），流速1.0 mL/min，柱温40 ℃，进样量20 µL。

2.2 质谱条件

高分辨Q-TOF/MS 测定，NaI 溶液（400 µg/mL）准确质量校正。电喷雾正离子化，喷雾电压4.0 kV，雾化气压力230 kPa，流量3 L/min，接口温度300 ℃，加热气流量10 L/min，干燥气流量10 L/min，氩气CID 碰撞能量5 ~ 50 eV，扫描范围m/z 50 ~2 000。

2.3 样品配制

Cbf-14 凝胶：将 Cbf-14 醋酸冻干粉 20 mg 和甘油100 mg 溶解于无菌纯净水860 mg 中，充分混匀并完全溶解。然后将甲基纤维素20 mg 搅拌加入上述溶液中，溶胀均匀后，离心除去气泡即得含量为2%的Cbf-14凝胶。

供试品溶液：取Cbf-14 凝胶适量（约相当于Cbf-14 10 mg），精密称定，置10 mL 量瓶中，加水适量，超声使Cbf-14 凝胶溶解，再以水稀释至刻度，摇匀，以0. 45µm 水系滤膜过滤，取续滤液即得质量浓度为1 mg/mL 的供试品溶液。精密量取上述溶液适量，加流动相定量稀释，配制0.5 %的自身对照溶液。

2.4 药物稳定性

查阅相关文献［11］，本研究对 Cbf-14 凝胶进行了酸、碱、氧化、高温和光照加速破坏，考察Cbf-14凝胶潜在的降解杂质。强制降解实验操作如下：取 Cbf-14 凝胶适量（约相当于Cbf-14 10 mg），加1.0 mol/L 盐酸溶液 1 mL 并于 60 ℃水浴放置 2 h，或加1 mol/L 氢氧化钠溶液1 mL 并于室温放置2 h，或加3%过氧化氢溶液1 mL 并于60 ℃水浴放置2 h，或于40 ℃烘箱中放置1 h，或于强光照射（1.62 × 106lx·h，324 W·h/m2，25 ℃）下放置10 d分别处理。酸碱处理溶液放置室温后分别用同浓度的酸碱溶液中和，高温干燥样品和强光照射样品分别加水适量，振摇使溶解。以上强制降解溶液分别加水稀释至10 mL，以0.45µm 水系滤膜过滤，取续滤液作为Cbf-14 质量浓度约为1 mg/mL 的强制降解试验溶液。同时采用空白溶液进行平行对照试验。

3 结 果

3.1 有关物质检查结果

对于含有芳香族氨基酸的多肽类物质的分析，苯基柱是一种独特的选择，因为它具有疏水相互作用和π-π 电子相互作用的双重分离机制，使其显示出与烷基键合硅胶固定相不同的特性，可以替代ODS 和C4 分析多肽和蛋白质。参考各国药典中关于胰岛素、醋酸奥曲肽、鲑降钙素和醋酸亮丙瑞林有关物质的分析方法，离子对色谱法最为常用。但是，这种分离模式不适用于LC-MS 联用技术。本研究开发了一种使用挥发性流动相的液相色谱质谱联用方法，用于在线分离和鉴定Cbf-14 凝胶制剂中的有关物质，并采用多级液相梯度以减少分析时间。

本研究建立了适用于Cbf-14 有关物质分离检查和MS鉴定的反相HPLC 方法。供试品溶液及其强制降解试验溶液有关物质的HPLC 检查结果见图1。按保留时间由小到大顺序对含量大于0.5%的主要有关物质进行识别和编号，共分离并检出24 个主要有关物质，其中有关物质19~23 为制剂生产工艺杂质，有关物质1~18和24为降解产物。

强制降解试验结果表明，本品对强酸、强碱、氧化、高温条件、强光照射均不稳定。在酸破坏条件下产生13 个主要降解产物（有关物质1 ~ 11、15、18，图1-a）；在碱破坏条件下产生4 个主要降解产物（有关物质12~14、16，图1-b）；在氧化破坏条件下产生2个主要降解产物（有关物质17、24，图1-c），有关物质24 的含量较大；在高温条件下产生4个主要降解产物（有关物质12~14、16，图1-d）；在光照条件下产生1 个主要降解产物（有关物质10，图1-e）。

Figure 1 Total ion chromatograms of Cbf-14 gel and its stressed test solutionsa:Acid;b:Alkaline;C:Oxidation;D:Pyrolysis;e:Photolysis;f:Cbf-14 gel;g:Cbf-14 API;h:Blank gel;i:0.5%Reference

3.2 Cbf-14质谱裂解规律

使用HPLC-QTOF/MS 对Cbf-14 及其有关物质在ESI+模式下进行质谱分析，质谱数据汇总见表1。Cbf-14 的［M + 3H］3+离子的精确质量数为m/z 607.068 8，与离子式［C86H154N27O16］3+相应。Cbf-14的MS/MS二级质谱图见图2-a，Cbf-14的MS/MS主要特征碎片为 m/z 880.574 7、735.482 7、601.393 4、574.045 9、539.031 7 和 533.356 3。m/z 880.574 7（［C85H148N24O16］2+）是由母离子中性丢失 1 分子胍（CH5N3）形成的；m/z 539.031 7（［C78H138N25O12］3+）归因于母离子C 端的Ser-Val 残基的中性丢失，在此基础上脱去1 分子NH3形成m/z 533.356 3（［C78H135N24O12］3+）；m/z 574.045 9（［C82H145N24O16］3+）是由母离子中性丢失1 分子C4H9N3，表明Cbf-14 分子中存在精氨酸残基。

3.3 Cbf-14凝胶中工艺杂质的结构鉴定

为了研究Cbf-14凝胶制剂的工艺相关杂质，对Cbf-14原料药和空白凝胶辅料进行对比分析，如图1 所示，原料药和空白辅料中均未检出含量大于0.5 %的杂质峰，Cbf-14 凝胶在 24.256 min 至31.507 min 处检出一系列含量在0.5 %左右的杂质峰，ESI（+）-QTOF-MS 共提取出 5 个不同的相对分子质量，编号为杂质19~23，推测以上杂质为工艺杂质。

Table 1 Related substances in Cbf-14 gel identified by LC-QTOF/MS

（Continued）

Figure 2 Product mass spectra of Cbf-14 gel and impurities 19-24A: Cbf-14 (m/z 607.068 8); B: Impurity 19 (m/z 611.067 4); C: Impurity 20 (m/z 615.739 4); D: Impurity 21 (m/z 621.071 0); E: Impurity 22 (m/z 625.743 0);F:Impurity 23(m/z 631.074 3);G:Impurity 24(m/z 606.723 6)

3.3.1 一级质谱数据解析 采用高分辨QTOF/MS 测定各有关物质的母离子及子离子的相对分子质量和元素组成，并与Cbf-14 的质谱特征进行对比分析，鉴定出各主要有关物质的结构。杂质19~23的一级质谱图见图3，质谱数据汇总见表1。分析一级质谱信息，共提取出10 种不同的加合物离子。其中，611.067 2、615.739 5、621.070 9、625.743 0、631.074 3为［M+3H］3+离子，916.100 8、923.109 2、931.106 4、938.114 5、946.111 4为相应的［M+2H］2+离子。

ESI（+）-QTOF-MS测得杂质19［M+3H］3+的m/z为611.067 2，与分子式C87H151N27O16相应，其相对分子质量为1 830.183 2，与Cbf-14 相比，其相对分子质量增加12，与Cbf-14 分子结构中引入一个亚甲基（CH2==）相应。

Figure 3 Mass spectrum of impurities 19-23 in Cbf-14 gel

ESI（+）-QTOF-MS测得杂质20［M+3H］3+的m/z为615.739 5，与分子式C88H153N27O16相应，其相对分子质量为1 844.198 9，与Cbf-14 相比，其相对分子质量增加26，与Cbf-14 分子结构中引入一个亚乙基（CH3CH==）相应。

ESI（+）-QTOF-MS测得杂质21［M+3H］3+的m/z为621.070 9，与分子式C88H153N27O17相应，其相对分子质量为1 860.193 8，与杂质20相比，其相对分子质量增加16，与杂质20 分子结构中引入一个氧（O）相应。

ESI（+）-QTOF-MS测得杂质22［M+3H］3+的m/z为625.743 0，与分子式C89H155N27O17相应，其相对分子质量为1 874.209 4，与杂质21相比，其相对分子质量增加14，与杂质21 分子结构中引入一个亚甲基（-CH2-）相应。

ESI（+）-QTOF-MS测得杂质23［M+3H］3+的m/z为631.074 3，与分子式C89H155N27O18相应，其相对分子质量为1 890.204 3，与杂质22相比，其相对分子质量增加16，与杂质22 分子结构中引入一个氧（O）相应。

Cbf-14 的分子结构中有8 个伯胺，其中有3 个来自精氨酸胍基、4 个来自赖氨酸氨基、1 个来自N端游离氨基酸。杂质19~23的MS/MS主要特征碎片有m/z 1 280.816 9、948.611 0和832.046 4，其中m/z 1 280.816 9（［C62H106N17O12］+）为KFFRKLKKSV碎片离子，m/z 948.611 0（［C48H78N13O7］+）为FFRKLKK碎片离子，m/z 832.046 4（［C80H141N23O15］2+）为LLRKFFRKLKKSV 碎片离子。根据二级质谱分析，所得结果表明甘油与Cbf-14 发生反应的位点为Cbf-14 的N 端精氨酸。此外，胍基是共轭结构，电子云分布均匀，其反应活性远低于伯胺。综上所述，杂质19 ~ 23 是甘油与Cbf-14 的N 端游离伯胺缩合形成的N 端亚胺产物，分别为N2-亚甲基-Cbf-14、N2-亚乙基-Cbf-14、N2-（2-羟基亚丙基）-Cbf-14、N2-（3-羟基亚丙基）-Cbf-14 和 N2-（2，3-二羟基亚丙基）-Cbf-14。

3.3.2 二级碎片裂解途径归属 杂质19 ~ 23 的MS/MS 二级质谱图见图2-b~图2-f，其二级碎片裂解规律总结如下：由于Cbf-14 富含赖氨酸和精氨酸，杂质19~23 在二级裂解过程中易于丢失中性碎片氨［NH3］、胍［NH==C（NH2）2］和精氨酸残基［C4N3H8］。杂质 19 ~ 23 还易于丢失 C 端的 Val 残基和Ser-Val 残基。对于N2-（3-羟基亚丙基）-Cbf-14 和N2-（2，3-二羟基亚丙基）-Cbf-14，由于具有游离羟甲基结构，二者均可以失去1 分子的甲醛。此外，N2-（2，3-二羟基亚丙基）-Cbf-14 的N 端精氨酸胍基上的伯胺可攻击α-碳形成二氮杂䓬七元环，在此基础上失去1 分子3-氨基-1，2-丙二醇［CH2（OH）CH（OH）CH2NH2］产生特征碎片离子m/z 600.720 1（［C60H149N26O16］3+），进一步失去 1 分子碳二亚胺［NH==C==NH］产生特征碎片离子m/z 586.712 8（［C85H147N24O16］3+），N2-（3-羟基亚丙基）-Cbf-14具有上述相同的裂解规律。

3.4 Cbf-14凝胶中降解产物的结构鉴定

在Cbf-14 凝胶强制降解试验样品中还鉴定出了 19 个有关物质。其中杂质 1 ~ 11、15、17、18 为Cbf-14 水解产物，杂质 12 ~ 14、16 为 Cbf-14 异构体，杂质24为Cbf-14氧化产物，以上杂质的质谱数据汇总见表1。

杂质1~11、15、17、18是Cbf-14在酸或氧化条件下肽键水解所产生的。根据二级质谱分析，杂质 1 是 Cbf-14（1-5），杂质 2 是 Cbf-14（7-14），杂质 3是 Cbf-14（1-4），杂质 4 是 Cbf-14（4-14），杂质 5 是Cbf-14（1-3），杂质 6 是 Cbf-14（5-14），杂质 7 是 Cbf-14（1-6），杂质 8 是 Cbf-14（6-14），杂质 9 是 Cbf-14（3-14），杂质10 是Cbf-14（1-12），杂质11 是Cbf-14（1-13），杂质 15 是Cbf-14（1-8），杂质 17 是 Cbf-14（2-14），杂质18是Cbf-14（1-10）。

杂质12 ~ 14、16 是Cbf-14 的同分异构体。一般来说，多肽分子中存在许多手性中心，常见的消旋化机制主要有以下两种类型：直接烯醇化和唑酮（氮杂内酯）的形成，它们都是碱催化的消旋化机制。

杂质24（m/z 606.723 6，z = 3）被鉴定为［1-AIMAOPA］Cbf-14，是Cbf-14 的氧化产物。HO·是非常强的氧化剂，在过渡金属催化的Fenton 或Udenfriend 反应条件下在原位生成。原位产生的HO·氧化，要么发生在氨基的α-碳上，要么在胍基的α-碳上。所得到的α-羟基氨基酸残基很容易分解，分别产生谷氨酸半醛和氨基己二酸半醛［12-13］。由于杂质24与API相对分子质量相差1，结合其碎片信息和Cbf-14 结构特征，推测杂质24 为Cbf-14 N 端游离氨基的α-C 上发生氧化所得的α-羟基氨基酸脱去1 分子的游离氨，产生的2-氧代精氨酸。形成机制见图4。

杂质24 的MS/MS 二级质谱图见图2-g，其主要特征碎片为 m/z 600.720 5、586.713 3、573.701 0、538.686 6 和 533.012 0。［1-AIMAOPA］Cbf-14 的 N端精氨酸胍基上的伯胺可攻击α-碳形成二氮杂卓七元环，在此基础上失去1分子H2O产生特征碎片离子m/z 600.720 5（［C60H149N26O16］3+），进一步失去1分子碳二亚胺［NH==C==NH］产生特征碎片离子m/z 586.713 3（［C85H147N24O16］3+）。 m/z 573.701 0（［C81H142N25O16］3+）是由母离子C端的Val残基丢失形成的；m/z 538.686 6（［C78H135N24O13］3+）归因于母离子C 端的Ser-Val 残基的中性丢失，在此基础上脱去1分子NH3形成m/z 533.012 0（［C78H132N23O13］3+）。

Figure 4 Formation mechanisms of aminoadipic semialdehyde,glutamate semialdehyde and 2-oxoarginine

4 讨 论

本研究建立了能够有效检测和分离Cbf-14 及其有关物质的挥发性流动相色谱条件，适用于Cbf-14 有关物质的色谱-质谱联用鉴定。在此条件下，共检测出24 个有关物质，其中5 个为制剂生产工艺有关物质，19 个为强制降解产物。对Cbf-14 有关物质结构及来源的推测对其生产工艺质量控制、评估药物稳定性及制定存储条件具有一定意义。

本研究建立的液相色谱-质谱联用法鉴定出Cbf-14 凝胶制剂生产工艺有关物质19~23 分别为N2-亚甲基-Cbf-14、N2-亚乙基-Cbf-14、N2-（2-羟基亚丙基）-Cbf-14、N2-（3-羟基亚丙基）-Cbf-14 和 N2-（2，3-二羟基亚丙基）-Cbf-14。以上杂质为凝胶辅料甘油与原料药Cbf-14 的N 端游离氨基缩合形成的N端亚胺产物，提示可能存在的原辅料相互作用。

强制降解试验表明，Cbf-14凝胶在酸性条件下易发生肽键水解产生特征有关物质1~11、15、18，在碱性条件或高温条件下易消旋异构产生特征有关物质12~14、16，在氧化条件下易产生水解产物17，并且易发生α-C 氧化形成脱氨氧代产物（有关物质24）。因此，Cbf-14 凝胶对酸、碱、氧化、高温及光照均比较敏感。Cbf-14 凝胶的储藏需密封避光，避酸避碱，尽量冷藏。