高效液相色谱法同时测定茉莉花纯露中5 种香气成分

2022-11-12张荣林吕敏薛亚馨陆小康陈小聪

化学分析计量 2022年10期

张荣林，吕敏，薛亚馨，陆小康，陈小聪

(广西-东盟食品检验检测中心，南宁 530029)

茉莉为木犀科素馨属植物，其花为著名的花茶原料及重要的香精原料，广西横县、四川犍为、福建福州、云南元江是我国茉莉花主要种植产地[1]。茉莉花辛甘、温，具有理气、开郁、辟秽、和中等功效[2]。茉莉花中含有挥发性成分，主要为芳樟醇、乙酸叶醇酯、苯甲酸甲酯、乙酸苄酯、顺-3-苯甲酸己烯酯、α-法尼烯、邻氨基苯甲酸甲酯、吲哚[3-7]，这些挥发性成分可用于窨制花茶和提取香精，以茉莉花提取的茉莉花净油、精油、纯露等加工品广泛使用于食品、医药和化妆品等行业[6]。茉莉花纯露是茉莉花通过水蒸气蒸馏，经冷凝收集得到的含有茉莉花香气成分的水溶液。研究表明，茉莉花中挥发性成分的种类及含量受到茉莉花品种[8]、产地[9-11]、环境[12，13]、花的开放程度[14]等因素影响，为了有效控制茉莉花纯露的质量，有必要建立茉莉花纯露中多种香气成分含量测定方法。茉莉花纯露中主要含有苯甲醇、邻氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸苄酯及芳樟醇等挥发性成分[3-7]，关于茉莉花及茉莉花精油、茉莉花净油中香气成分的定性分析和含量测定已有研究[15-17]，但同时测定茉莉花纯露中苯甲醇、邻氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸苄酯及芳樟醇5 种挥发性成分的含量尚未见报道。食品、药品中挥发性成分含量的测定多采用气相色谱法检测[18-21]，但我国气相色谱仪普及率低于液相色谱仪，同时液相色谱具有适用性强，应用范围广等特点，因此利用高效液相色谱测定茉莉花纯露中挥发性成分具有重要意义。

笔者参考文献[22-23]，采用高效液相色谱法同时测定茉莉花纯露中苯甲醇、邻氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸苄酯和芳樟醇等5 种香气成分含量，为建立茉莉花纯露的质量标准、品质评价方法提供数据和参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Prominence-i LC-2030C 型，配有Labsolution 工作站，二极管阵列检测器，日本岛津公司。

电子分析天平：XS-205DU 型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

苯甲醇标准物质：质量分数为99.9%，编号为CDCT-C10569000，德国Dr.Ehrenstorfer 公司。

乙酸苄酯标准物质：质量分数为99.4%，编号为DRE-C10015515，德国Dr.Ehrenstorfer 公司。

邻氨基苯甲酸甲酯标准物质：质量分数为99.9%，编号为MAI-722306，美国Stanford Analytical Chemicals 公司。

吲哚标准物质：质量分数为99.5%，编号为CCFD 200282，美国CATO 公司。

芳樟醇标准物质：质量分数为98.4%，编号为CCFD 200166，美国CATO 公司。

乙腈、甲醇：均为色谱纯，德国默克公司。

茉莉花纯露样品：市售。

实验用水为去离子水，由Millipore 型纯水机制备。

1.2 色谱条件

色谱柱：Ultimate XB-C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，月旭科技(上海)股份有限公司]；流动相：A 为乙腈，B 为水，流量为1.0 mL/min；梯度洗脱程序：0～6 min 时，流动相A 体积分数为42%，6～10 min 时，流动相A 体积分数由42%逐渐增加至65%，10～15 min 时，流动相A 体积分数由65%逐渐增加至90%，15～20 min 时，流动相A 体积分数为90%，20～25 min 时，流动相A 体积分数为42%；检测波长：205 nm，柱温：35 ℃，进样体积：10 μL。

1.3 溶液配制

1.3.1 5 种香气成分混合标准储备液

分别称取苯甲醇、邻氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸苄酯、芳樟醇标准物质适量，精密称定，用甲醇溶解、稀释、定容，配制成5 种香气成分混合标准储备液，其中苯甲醇质量浓度为1.209 mg/mL、邻氨基苯甲酸甲酯质量浓度为1.083 mg/mL、吲哚质量浓度为1.073 mg/mL、乙酸苄酯质量浓度为1.062 mg/mL、芳樟醇质量浓度为1.099 mg/mL。

1.3.2 5 种香气成分系列混合标准工作溶液

精密量取5 种香气成分混合标准储备液0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL，分别置于6 只10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至标线，混匀，配制成苯甲醇质量浓度分别为6.045、12.09、24.18、48.35、96.70、120.9 μg/mL，邻氨基苯甲酸甲酯质量浓度分别为5.415、10.83、21.66、54.15、86.64、108.3 μg/mL，吲哚质量浓度分别为5.366、10.73、21.47、53.66、85.86、107.3 μg/mL，乙酸苄酯质量浓度分别为5.311、10.62、21.25、53.11、84.98、106.2 μg/mL，芳樟醇质量浓度分别为5.496、10.99、21.98、54.96、87.93、109.9 μg/mL 的系列混合标准工作溶液。

1.3.3 样品溶液

精密吸取茉莉花纯露2.00 mL 至10 mL 容量瓶中，用水定容至标线，混匀，经0.22 μm 微孔滤膜过滤后，供液相色谱仪测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

2.1.1 检测波长选择

采用二极管阵列检测器，在200～400 nm 波长范围内分别扫描5 种香气成分混合标准工作溶液(苯甲醇、邻氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸苄酯、芳樟醇质量浓度分别为12.09、10.83、10.73、10.62、10.99 μg/mL)以及样品溶液，苯甲醇、邻氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸苄酯和芳樟醇的紫外吸收光谱如图1所示。由图1 可以看出，芳樟醇为末端吸收，苯甲醇最大吸收波长为205 nm，邻氨基苯甲酸甲酯最大吸收波长为216 nm，吲哚最大吸收波长为218 nm，乙酸苄酯最大吸收波长为206 nm。综合各组分紫外吸收情况，确定采用检测波长205 nm 同时测定苯甲醇、邻氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸苄酯和芳樟醇，在此波长下基线稳定，未见明显漂移。

图1 5 种香气成分紫外吸收光谱图

2.1.2 色谱柱选择

分别考察Ultimate XB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil 100-5-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Zorbax SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil GOLD aQ 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)对5 种香气成分的分离效果。结果表明，4种品牌的色谱柱均能较好地分离苯甲醇、邻氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸苄酯和芳樟醇，但相同条件下Ultimate XB-C18柱色谱峰形最好，分离度满足要求，且未见其它成分干扰，因此选择Ultimate XB-C18色谱柱。

2.1.3 流动相选择

分别考察了乙腈-水溶液、甲醇-水溶液两种流动相体系，结果表明，以甲醇-水溶液作为流动相时，由于甲醇溶液受到紫外末端吸收的影响，基线波动较大。乙腈的传质阻力小于甲醇，同时乙腈和甲醇分别用同样的比率与水混合时，乙腈的洗脱能力更强，色谱峰形更尖锐，因此选择乙腈-水溶液作为流动相。

调节乙腈-水的体积比分别为65∶35、50∶50进行试验，结果发现，以乙腈-水溶液(65∶35)作为流动相时，邻氨基苯甲酸甲酯和吲哚的色谱峰部分重合，无法实现基线分离；以乙腈-水溶液(50∶50)作为流动相时，邻氨基苯甲酸甲酯和吲哚的色谱峰分离度大于2，但芳樟醇的出峰时间延后，单针分析时间大于40 min。采用梯度洗脱，并对流动相配比进行优化，5 种待测组分均实现基线分离，分析时间小于20 min，提高了分析效率，节约了分析成本，梯度洗脱程序见1.2。

2.2 色谱分离效果

分别精密吸取5 种香气成分混合标准工作溶液和样品溶液，按1.2 色谱条件进样测定，色谱图如图2 所示。由图2 可以看出，芳樟醇、邻氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸苄酯、芳樟醇的保留时间分别为4.967、10.537、11.406、11.797、14.189 min，理论塔板数均不低于15 000，各成分分离度均大于2，色谱峰形良好。

图2 混合标准工作溶液和样品溶液色谱图

2.3 线性方程与检出限

取1.3.2 中的系列混合标准工作溶液，按1.2 色谱条件进样测定，记录各成分色谱峰面积，以溶液质量浓度(x，μg/mL)为横坐标、色谱峰面积(y)为纵坐标绘制标准工作曲线，计算线性方程和相关系数。取5 种香气成分混合标准工作溶液，用甲醇逐级稀释，在1.2 色谱条件下分别进样测定，以3 倍信噪比时的质量浓度作为方法检出限，以10 倍信噪比时的质量浓度作为定量限。5 种目标物质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表1。

表1 5 种目标物质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.4 精密度试验

取同一批茉莉花纯露样品，按1.3.3 方法平行制备6 份样品溶液，在1.2 色谱条件下分别进样测定，结果见表2。由表2 可知，苯甲醇、邻氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸苄酯及芳樟醇5 种目标物测定结果的相对标准偏差分别为1.11%、0.41%、0.31%、0.62%、0.59%，表明该方法精密度良好。

表2 精密度试验结果

2.5 稳定性试验

吸取1.3.3 中的样品溶液10 μL，在1.2 色谱条件下，分别间隔0、5、10、14、18、24 h 进行测定，记录5 种目标物的色谱峰面积，结果见表3。由表3 可知，苯甲醇、邻氨基苯甲酸甲酯、吲哚、乙酸苄酯和芳樟醇色谱峰面积测定结果的相对标准偏差分别为1.11%、1.05%、0.83%、0.69%、0.62%，表明样品溶液在24 h 内稳定性良好。

表3 稳定性试验结果

2.6 加标回收试验

精密吸取已知含量的茉莉花纯露样品9 份，每份1.00 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，分别加入含苯甲醇0.157 1 mg/mL、邻氨基苯甲酸甲酯0.108 3 mg/mL、吲哚0.162 5 mg/mL、乙酸苄酯0.637 4 mg/mL、芳樟醇0.252 8 mg/mL 的混合标准溶液100、200、300 μL，用水定容至标线，摇匀，配制成低、中、高3 种加标质量浓度水平的样品溶液，在1.2色谱条件下分别进样测定，结果见表4。由表4可知，5 种目标物加标回收率为97.13%～108.40%，表明该方法准确度良好，满足定量分析要求。