皮肤扁平苔藓中miR-27b与相关蛋白表达及意义

杨培,梁淑雅,王苗苗,韩莎莎,李媛媛,王君

(1 青岛大学附属医院皮肤科,山东 青岛 266003； 2 青岛市妇女儿童医院皮肤科)

扁平苔藓(LP)是一种皮肤和黏膜的炎症性疾病，其患病率约为1%，女性患病率高于男性[1]。尽管LP的发病机制尚不完全清楚，但是T细胞介导的免疫和炎性反应在其发病机制中发挥了重要作用[2]。microRNA(miRNA)是小的非编码RNA，可通过调控相关基因的表达来调节细胞活性，在自身免疫以及细胞增殖、分化和凋亡中起关键作用，而miRNA失调可能与自身免疫和炎症性疾病的发病机制有关[3-4]。miR-27b是miRNA家族中的一员，有研究显示，在口腔扁平苔藓(OLP)中其表达水平降低[5]。经双荧光素酶报告基因实验验证，白细胞介素1β(IL-1β)是miR-27b的潜在靶蛋白[6]。已有研究表明，皮肤扁平苔藓(CLP)组织中IL-1β的表达上调[7]。然而，miR-27b靶向IL-1β是否在CLP的发病机制中发挥作用还未被证实。LI等[8]通过Western blot检测发现，miR-27b过表达明显抑制血小板衍生生长因子BB诱导的基质金属蛋白酶9(MMP-9)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达升高。然而，miR-27b及其相关蛋白MMP-2在CLP中的表达关系尚未见报道。本研究旨在探讨miR-27b与其靶蛋白IL-1β以及相关蛋白MMP-2在CLP中的表达水平及意义。

1 资料和方法

1.1 研究对象

2019年5月—2020年5月，选取于青岛大学附属医院皮肤科就诊的CLP病人40例(CLP组)，并采集皮损组织标本。CLP组纳入标准：临床表现典型并经组织病理学确诊(典型病例见图1)，无系统性疾病，3个月内未使用免疫抑制剂或糖皮质激素类药物。同期选取在青岛大学附属医院美容外科手术的40例健康人(Con组)作为对照，收集手术切取的正常皮肤组织标本。CLP组男22例，女18例，年龄25～64岁；Con组男19例，女21例，年龄19～61岁。两组性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，受试者自愿签署知情同意书。

1.2 实时荧光定量PCR检测miR-27b的表达

采用Trizol法(试剂购自日本Takara公司)提取两组皮肤组织总RNA，并参照逆转录试剂盒(日本Takara公司)操作步骤将定量后的RNA逆转录合成cDNA。以cDNA为模板，将配制好的20 μL反应体系(含有2×SYBR Green PCR Master Mix 10.0 μL，cDNA 1.0 μL、上下游引物各0.4 μL、H2O 8.2 μL)按照设定的反应条件(94 ℃、5 min，94 ℃、15 s，58 ℃、15 s，72 ℃、30 s，共循环35次)上PCR仪进行扩增。miR-27b和U6引物由上海生工公司合成，其序列见表1。采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达水平。

表1 PCR引物及其序列

1.3 酶联免疫吸附测定法检测IL-1β和MMP-2的表达

根据人IL-1β和MMP-2酶联免疫吸附测定试剂盒(日本Takara公司)说明书操作步骤检测两组皮肤组织中IL-1β以及MMP-2的含量，于450 nm波长处依序测量各孔的光密度(OD)值。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 两组miR-27b、IL-1β、MMP-2表达水平比较

CLP组miR-27b的表达水平明显低于Con组，IL-1β和MMP-2的表达水平明显高于Con组，差异均有统计学意义(t=-2.487～2.501，P<0.05)。见表2。

表2 两组miR-27b、IL-1β和MMP-2表达水平的比较

2.2 miR-27b、IL-1β、MMP-2表达水平的相关性

Spearman相关分析显示，CLP组皮损组织中miR-27b与IL-1β、MMP-2表达水平呈负相关(r=-0.361、-0.385，P<0.05)，IL-1β与MMP-2表达水平呈正相关(r=0.332，P<0.05)。见图2。

3 讨 论

LP是一种慢性自身免疫疾病，T细胞介导的免疫反应对基底层角质形成细胞造成破坏在LP发病机制中发挥重要作用[9]。miR-27b为角质形成细胞特异性miRNA，参与了角质形成细胞的分化[10]。WANG等[11]研究证实，miR-27b改善了角质形成细胞的迁移，而miR-27b下调则增加了角质形成细胞的凋亡。有研究表明，miR-27b作为OLP的生物标志物具有很高的敏感性(高达100%)，其在OLP黏膜组织、血清和唾液中的表达均显著下调[12-13]。ZHANG等[10]的研究证实，OLP的临床严重程度与miR-27b下调水平有关。CHEN等[14]的研究发现，miR-27b通过靶向Polo样激酶2(PLK2)促进OLP角质形成细胞增殖。另有研究证实，OLP黏膜组织中miR-27b-3p通过环蛋白D/Bcl2信号通路调控角质形成细胞凋亡[15]。ZHANG等[10]认为，OLP上皮角质形成细胞中miR-27b的下调可能是活化细胞毒性T细胞特异性炎症反应的一部分，并且可能触发上皮细胞凋亡。到目前为止，还未见针对miR-27b在CLP中表达的研究。

研究表明，LP的组织病理学特征之一是基底膜的破坏[16]。基底膜依赖性酶的蛋白水解活性升高可造成基底膜损伤，进而触发角质形成细胞的凋亡。基质金属蛋白酶是锌和钙依赖性的蛋白水解酶，MMP-2是所有基质金属蛋白酶中分布最广泛的一种[17]。MMP-2或Ⅳ型胶原酶可以破坏基底膜的主要糖蛋白成分Ⅳ型胶原蛋白，并参与血管和炎症过程的调节[18]。在对卵巢癌细胞和视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)的研究中发现，miR-27b可以下调MMP-2的表达。WANG等[19]研究证实，OLP中MMP-2的表达显著上调，miR-125b可通过PI3K/Akt/mTOR途径靶向MMP-2抑制角质形成细胞的增殖并促进角质形成细胞凋亡。关于CLP中MMP-2表达的研究结果仍有差异。GIANNELLI等[20]首次研究了CLP和MMP-2的关系，结果显示，在CLP急性期MMP-2的表达和活性增加，并暗示MMP-2和基质金属蛋白酶组织抑制因子2(TIMP-2)之间的失衡可能在基底膜破坏中发挥作用。但GUNDUZ等[21]研究发现，MMP-2在CLP皮损的表皮基底层中表达弱，在基底层破坏显著区域甚至不表达，认为这一结果可以用表皮基底层的破坏来解释，得到不同的结果可能因疾病所处阶段不同所致。

A：病人临床表现为右下肢紫红色扁平丘疹、斑块；B：病人组织病理学检查显示表皮角化过度，颗粒层楔形增厚，棘层不规则增厚，基底细胞液化变性及真皮上部淋巴细胞带状浸润(苏木精-伊红染色，100倍)。

A：miR-27b与IL-1β表达的相关性；B：miR-27b与MMP-2表达的相关性；C：IL-1β与MMP-2表达的相关性。

目前生物信息学研究证明，IL-1β是miR-27b的靶蛋白之一[6]。人角质形成细胞是促炎细胞因子IL-1β的主要来源。IL-1β作为角质形成细胞激活的启动子，可激活各种细胞内信号传导途径[22]。此外，IL-1β已被证实有促进胶原酶合成、抑制胶原分泌的作用。在一项关于成纤维样滑膜细胞凋亡的研究中，作者发现miR-27b表达增加可抑制IL-1β表达和核因子κB(NF-κB)信号传导[6]。另有研究表明，IL-1β以剂量和时间依赖性方式提高前交叉韧带成纤维细胞中MMP-2蛋白表达和酶活性[23]。本研究检测了miR-27b、IL-1β和MMP-2在CLP中的表达水平，结果显示，与Con组相比，CLP组miR-27b的表达水平显著下降，IL-1β和MMP-2的表达水平显著上调。相关性分析显示，CLP组病人miR-27b与IL-1β和MMP-2的表达水平均呈显著负相关，IL-1β与MMP-2的表达水平呈显著正相关。提示miR-27b的异常表达可能导致IL-1β、MMP-2的表达上调，破坏基底膜，触发角质形成细胞的凋亡，参与CLP的发病过程。

综上所述，miR-27b可能通过负调控相关蛋白的表达参与CLP的发病过程。这为进一步揭示LP的发病机制提供了有益参考，为未来该病治疗靶点的筛选提供了一定的理论依据。