Cx43在老年性聋小鼠耳蜗中的表达及意义

黄兴玉，饶 澄，苏琳凌，李 欢，王世飞

(遵义医科大学附属医院 耳鼻咽喉科，贵州 遵义 563099)

老年性聋(Presbycusis)是随着年龄增长而出现听力逐渐减退的现象，多表现为双耳听力的对称性感音神经性高频下降[1-2]。在中国，该病是第二大严重影响老年人生活质量的非致病性疾病。近年来，国内外对老年性聋的发生机制及病理生理学特征进行研究，认为老年性聋患者言语识别率降低可能与耳蜗带状突触病变有关，耳蜗带状突触病变主要影响内毛细胞(Inner hair cell，IHC)间联系，降低神经纤维自发放电率，受影响神经细胞功能障碍造成嘈杂环境中言语识别率降低[3]。人类颞骨标本解剖学研究示随年龄增长，每IHC突触比由约13.3降至2.0[4]。同时，有研究证明，确定内毛细胞-突触功能障碍是老年性耳聋患者言语识别率骤降的主因[5]。Liu对大鼠出生后耳蜗发育过程中连接蛋白43(Connexin 43，Cx43)的表达模式进行分析，认为Cx43可能是耳蜗带状突触功能正常发挥的关键[6]，近年来，有个别报道在老年性聋鼠模型中检测到了Cx43蛋白的表达降低[7]，说明Cx43与老年性聋可能有关，但具体机制尚不清楚。本研究拟通过动物实验水平检测Cx43蛋白的表达，观察小鼠耳蜗带状突触的变化，研究Cx43蛋白表达变化与耳蜗带状突触老化之间的关系，进而探讨二者在老年性聋发生发展中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 选C57BL/6J 雄性小鼠进行动物实验研究。实验前检查外耳道，排除中耳炎及其他外耳道异常。选取16月龄C57BL/6J雄性小鼠作6只为老年组。将12只3月龄C57BL/6J雄性小鼠随机均分为两组，D-gal拟老年性聋模型鼠组采用经典D-gal衰老模型制造方法，每天颈背皮下注射5% D-gal 500 mg/kg，注射时长为8周，对照组每天颈背皮下注射等体积生理盐水，注射时长为8周。小鼠被安置在可自由进入标准实验室内，进食、水的可控驯化环境条件下。本研究已获遵义医科大学伦理委员会批准。(伦理审查编号：KLLY(A)-2021-131)。

1.2 主要仪器 酶标仪(Rayto，美国)；垂直蛋白电泳装置(天能公司，中国)；凝胶成像仪(Vilber公司，法国)；场发射扫描电镜(HITACHI，日本)。

1.3 主要试剂 电泳液、ECL化学发光试剂、梯度酒精、2%四氧化锇溶液、2.5%戊二醛溶液、Bicin Choninic Acid蛋白定量试剂盒(碧云天公司，中国)；兔抗鼠Cx43/GJA1多克隆抗体(abcam公司)；SDS-PAGE凝胶(碧云天公司，中国)；Mouse GJA1 / CX43 / Connexin 43 (Sandwich ELISA) ELISA Kit(LSBio，美国)；蛋白裂解液(碧云天公司，中国)；单宁酸,HRP标记山羊抗兔二抗(三鹰生物技术有限公司，中国)。

1.4 D-gal老年聋模型鼠的构建 选用耳廓反应灵敏，鼓膜完整，ABR阈值在正常听力级的健康雄性3月龄C57BL/6小鼠造模。为检验D-gal造模是否成功，本实验采取测量造模前后听觉脑干电位(Auditory brainstem responses,ABR)以验证造模效果。

1.5 小鼠听性脑干反应测试 在声电屏蔽室内进行，并保持周围环境安静。小鼠采用戊巴比妥钠联合盐酸西拉嗪进行麻醉。麻醉满意后开始测试ABR阈值，纯音给声(持续时间5 ms，21次/s)，测试频率为4，8，16，24、32 kHz，声强区间为20～90 dB SPL，ABR记录并做1 024次平均，阈值由ABR Ⅰ，Ⅲ和Ⅴ波变化情况综合确定。

1.6 耳蜗标本采集 取各组小鼠，全麻后( 2% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为 50 mg/kg)在显微镜下，将小鼠固定于脑立体定位仪,断头处死动物，相应组依次取出听泡后，去除多余组织，打开听泡，将耳蜗进行分离，采集标本后，用4 ℃生理盐水洗净耳蜗样本，并将样本(耳蜗) 置入-80 ℃冰箱中进行保存。

1.7 扫描电镜观察 各组各取两个听泡，暴露耳蜗，显微镜下刺破蜗顶和圆窗膜，置于2.5%戊二醛中充分固定48 h，在2.5%戊二醛溶液中剥除耳蜗骨质、血管纹、支持韧带、前庭膜及盖膜，剪取基底膜，置于2.5%戊二醛中继续固定，随后置于2%四氧化锇溶液及单宁酸溶液中继续固定和增加导电性，梯度酒精脱水，干燥，喷金，扫描电镜观察。

1.8 Western blot法测定耳蜗Cx43蛋白表达水平 收集各组小鼠基底膜置于EP管中剪碎，加入蛋白裂解液充分裂解，离心后取上清，BCA法测蛋白浓度后加缓冲液，煮沸变性，经电泳、转膜、封闭后依次孵化β-actin一抗、Cx43一抗(1∶100 0)、二抗(1∶200 00)，滤纸沥吸干，滴ECL发光液，凝胶成像仪拍照。

1.9 酶联免疫吸附测定(Elisa)法测定耳蜗Cx43蛋白表达水平 收集各组小鼠基底膜置于EP管中剪碎，加入蛋白裂解液充分裂解，离心后取上清，BCA法测蛋白浓度后常规处理，取上清液待测定。标准品溶液于待测样品按1∶1至1∶32梯度稀释。37 ℃温育90 min。待测，加入100 μL1x Biotinylated Detection Antibody，孵育，清洗。最后1次洗涤后，抽吸以除去任何剩余的洗涤缓冲液，加入100 μL 1x HRP辣根过氧化物酶标记，孵育，清洗5次。加入TMB底物溶液，孵育，避光检测至最佳显色效果。加停止反应液，用450 nm酶标仪测定每孔的光密度(OD值)。

1.10 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料比较用单因素方差分析，有差异者进一步采用LSD行两两比较，耳蜗组织中Cx43蛋白表达、耳蜗带状突触宽度以及ABR阈值的相关性分析用Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ABR阈值 对3组小鼠听觉脑干电位ABR 阈值进行比较(见图1、2)。与对照组的正常范围的听觉脑干电位ABR阈值相比，老年组和D-gal组小鼠的听觉脑干电位ABR阈值明显升高(P<0.05)。老年组和D-gal组小鼠之间比较的听觉脑干电位ABR阈值无统计学差异。

图1 3组小鼠听觉脑干电位 ABR 阈值

**：与对照组相比，P<0.01，n=6。图2 3组小鼠听觉脑干电位ABR阈值均值

2.2 耳蜗带状突触扫描电镜观察 通过电镜观察小鼠耳蜗带状突触，相较于对照组，老年组和D-gal组耳蜗带状突触宽度明显缩小(P<0.05,见图3)。

A：对照组小鼠耳蜗带状突触电镜图；B：老年组小鼠耳蜗带状突触电镜图；C：D-gal 组小鼠耳蜗带状突触电镜图；D：小鼠耳蜗带状突触宽度；**、***:与对照组相比，P<0.01，P<0.001，n=3。图3 小鼠耳蜗带状突触扫描电镜

2.3 耳蜗Cx43蛋白表达 通过WB对3组小鼠耳蜗Cx43蛋白表达进行检测(见图4)。相较于对照组，老年组和D-gal组小鼠的耳蜗Cx43蛋白表达明显降低(P<0.05)，而老年组和D-gal组小鼠耳蜗Cx43蛋白表达无统计学差异。

*：与对照组相比，P<0.05，n=3。图4 WB检测3组小鼠耳蜗Cx43蛋白表达

通过Elisa对3组小鼠耳蜗Cx43蛋白表达进行检测(见图5)。相较于对照组，老年组和D-gal组小鼠的耳蜗Cx43蛋白表达明显降低(P<0.05)，而老年组和D-gal组小鼠耳蜗Cx43蛋白表达无统计学差异。

***：与对照组相比，P<0.001，n=6。图5 Elisa检测3组小鼠耳蜗Cx43蛋白表达

2.4 Cx43蛋白表达与ABR阈值 3组小鼠的耳蜗Cx43蛋白表达与听觉脑干电位ABR阈值之间具有相关性(r=0.74,P<0.001)，在老年聋小鼠及D-gal模型鼠中，与对照组相比，Cx43蛋白表达降低，ABR阈值升高(见图6)。

图6 耳蜗Cx43蛋白表达与听觉脑干电位ABR阈值的相关性分析

2.5 Cx43蛋白表达与耳蜗带状突触宽度 3组小鼠的耳蜗Cx43蛋白表达与耳蜗带状突触宽度之间具有相关性(r=0.83,P<0.001)，在老年聋小鼠及D-gal模型鼠中，和对照组相比，Cx43蛋白表达降低，带状突触宽度降低，结果具有统计学意义(见图7)。

图7 耳蜗Cx43蛋白表达与耳蜗带状突触宽度的相关性分析

3 讨论

随着我国人口老龄化的加剧，老年性聋的发病率呈逐年急剧增涨趋势，需予以高度重视[8]，目前，关于老年性聋的发生发展机制尚不明确，主要有以下研究假说：胞间交流障碍、血供障碍、炎症因子风暴以及神经-突触结构异常等[9-11]。既往研究认为耳蜗微循环障碍是老年性聋发病的主要机理，但其无法解释为何部分耳蜗血供正常的患者却发生了老年性聋。

而最新国内外研究提示，耳蜗带状突触结构老化可能是老年性聋发病的更关键因素[12]。带状突触(Ribbonsynapse，RS)是声音信号传递至中枢所经过的最起始的突触结构，也是信息传导以及释放的关键位点，可使声音信号能够瞬时、高保真并持续性的从内毛细胞(Inner hair cell，IHC)传入相连接的听觉纤维，耳蜗毛细胞将声音刺激转换为生物电信号，对声音的编码以及听力的维持拥有着无法替代的作用[13-15]。此外，研究还发现，随着小鼠逐渐衰老，带状突触的形态结构以及数量都将发生改变，同时也会出现不同程度的感音神经性听力损失[16-17]。 本研究中，老年组和D-gal组的脑干电位ABR阈值较正常组明显升高，而耳蜗带状突触宽度则明显缩小，说明随着小鼠年龄的增长，带状突触也开始逐渐老化，听力阈值增高，进一步提示耳蜗带状突触老化可能是老年性聋的关键发病机制。

连接蛋白 43(Connexin43，Cx43) 是由 GJA1 基因所编码，在耳蜗组织(血管纹、皮质器、螺旋韧带、螺旋神经节的支持细胞以及前庭感觉的上皮等)中广泛表达，是听觉感受器官空间三维排列的基础[18]。有报道称，在部分非综合征型耳聋患者中可见Cx43突变，可能是因为Cx43蛋白表达异常干扰重要的耳蜗信号、毛细胞的功能和可能的营养供应，进而导致耳聋[19]。动物实验中，常在老年性聋小鼠模型中检测到Cx43表达的降低，提示Cx43的低表达与老年聋性的发病密切相关[20]。Si等[21]在D-gal 致衰老模型豚鼠中，测得耳蜗螺旋动脉上Cx43 mRNA及Cx43表达低于对照，原代 SMA 血管平滑肌细胞中Cx43表达水平同样低于对照。Zhang等[18]研究表明，Cx43蛋白表达下调影响血管纹血管通透性，对内耳血-迷路屏障造成一定影响，造成听力下降。本研究通过WB和Elisa实验对小鼠耳蜗Cx43蛋白表达检测，发现相较于对照组，老年组和D-gal组小鼠的耳蜗Cx43蛋白表达明显降低，而Cx43蛋白表达与听觉脑干电位ABR阈值之间呈负相关，提示随着耳蜗Cx43蛋白表达降低，听觉脑干电位ABR阈值升高，耳蜗Cx43蛋白可能参与老年性聋的发生发展，可能对疾病的严重性有一定预测作用。

耳蜗毛细胞带状突触出生时即已存在，出生后逐渐发育和完善，听觉发生与带状突触成熟时间高度吻合，表明成熟带状突触的形成可能是听觉发生的前提条件之一[21]。有研究证明，老年性耳聋患者言语识别率降低与耳蜗突触病变有关，耳蜗突触病变参与了老年人听觉通路的退化，并逐渐从耳蜗发展并扩散到听觉神经[16]。本研究也证实了这一观点，即随着带状突触的老化，听力阈值增高。另外，本研究还发现Cx43蛋白在老年小鼠及D-gal老年聋模型鼠的耳蜗中表达降低，同时出现耳蜗带状突触宽度的降低及ABR阈值的升高。提示Cx43蛋白含量会引起耳蜗带状突触发生形态变化，其含量的下降参与老年性聋的发生发展。

本研究发现Cx43蛋白在老年性耳聋的发生发展中发挥着重要的作用，且Cx43蛋白的表达与耳蜗带状突触宽度呈正相关，而与听觉脑干电位ABR阈值之间呈负相关，提示Cx43蛋白可能通过介导耳蜗带状突触老化参与老年性聋的发生发展。本研究不仅为解释老年性聋发生发展的机制提供了方向，同时为老年性聋的防治及个体化治疗提供了新的治疗方案及思路，但对于小鼠各生命周期中Cx43含量的动态变化规律，还需另行实验和深入探讨。