液质联用和网络药理学用于复方斑蝥胶囊治疗原发性肝癌的机制研究

贾清馨，周 巡，赖华清，郭延垒，张建永

(1.遵义医科大学 药学院药物分析教研室，贵州 遵义 563099；2.重庆市中药研究院 药理毒理所，重庆 400065)

原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是世界最常见的恶性肿瘤之一[1]，最新数据报告显示，全球PLC死亡病例占4.7%，位居所有恶性肿瘤的第六位；死亡率高达8.3%，在癌症死亡顺位中位列第三[2]，因此研发新型抗PLC药物具有重要意义。

复方斑蝥胶囊(Fufang banmao capsule，FFBM)由人参、斑蝥、黄芪、刺五加、三棱、半枝莲、莪术、山茱萸、女贞子、熊胆粉及甘草共计11味中药材加工而成的中药复方制剂，其临床效果显著，常用于PLC，肺癌及直肠癌等的治疗[3-4]，尤其对PLC有显著疗效。临床研究发现FFBM辅助PLC治疗可有效延长患者的中位生存时间，降低死亡率[5]。进一步研究发现FFBM联合肝动脉插管栓塞化疗能显著提高PLC治疗效果，改善患者生活质量，患者治疗后肿瘤标志物AFP、CEA、CA199均有不同程度降低，免疫细胞因子VEGF、HIF-1α含量均明显降低[1]。进一步抗肿瘤机制研究发现FFBM治疗PLC与调节免疫功能、抑制肝癌细胞增殖有关，但是其抗PLC的潜在的有效成分、作用机制等尚未完全阐明。

网络药理学的整体性、系统性与中医药的整体观、辨证论等基本理论趋于一致，因此基于网络药理学对中药复方的机制机理进行分析，在中药复方机制研究中发挥越来越重要的作用[5-6]。本研究采用高分辨质谱分析技术对网络药理学筛选得到的潜在成分进行靶向性分析，并对核心成分与其对应靶标进行分子对接验证，从而分析FFBM对PLC的有效成分、潜在靶标和作用机制，以期为FFBM的进一步开发应用提供研究依据。

1 资料与方法

1.1 软件与数据库 应用TCMSP数据库(https://lsp.nwu.edu.cn)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、Drugbank数据库(https://www.drugbank.ca/)、ETCM数据库(http://www.nrc.cn:9090/ETCM/)、PubChemCompound数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、UniProt数据库(https：//www.uniprot.org/)、STRING数据库(https：//string-db.org/)、DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)数据库、PDB数据库(http：//www1.rcsb.org/)、Peakview Software Version:1.2.0.3。等数据库收集整理相关化合物、靶标等信息；采用Cytoscape3.6.0、Discovery Studio 2016 Client、Chem Draw Ultra 7.0等应用软件进行数据处理、分子对接等。

1.2 仪器与材料 FFBM(批号：161105，贵州益佰制药股份有限公司)；UPLC-Q-TOFHRMS高分辨液质联用(AB SCIEX,Framingham,MA,USA)；LC30A系统(UFLC)(Shimadzu,Kyoto,Japan)；QExactive型高分辨质谱(Thermo Fisher Scientific)；Phenomenex Kinetex C18100A色谱柱(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；十万分之一分析天平；甲醇(色谱纯，Fisher)；乙腈(色谱纯，Fisher)；水(超纯水)，其余均为色谱纯。

1.3 供试品溶液的制备 取FFBM本品3粒，剥去胶囊外壳后，取其内容物，于分析天平上精密称定约0.500 g，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇∶乙腈：水(4∶4∶2)溶液8 mL后，超声提取(功率80W)30 min，取出放冷后，以醇∶乙腈∶水(4∶4∶2)溶液定容。取1 mL提取液离心(12 000 r/min)10 min，进样分析。

1.4 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Kinetex C18100A色谱柱(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：2 μL；流动相：A相，0.1%甲酸-水；B相，0.1%甲酸-乙腈；梯度洗脱为：0～1 min，0%～10%B；1～7 min，10%～85% B；7～11 min，85% B；11～11.5 min，85%～10% B；11.5～15 min，10%～0% B。

1.5 质谱条件 UPLC-Q Exactive 型液质联用系统：离子源采用HESI源(heated ESI)，使用动态背景扣除(DBS)触发信息关联采集模式(IDA)的方式进行扫描，Gas1：55Psi；Gas2：55Psi；IS：4 500V；TEM：600 ℃；CUR：25Psi。

1.6 化合物结构分析 质谱进样分析后，数据导入Peakview software Version:1.2.0.3鉴定分析软件拟合可能存在的分子式，利用自建二级质谱数据库及相应裂解规律匹配法对含有MS/MS数据的峰进行物质鉴定。

1.7 药材成分靶标收集 根据文献并结合计算系统生物学实验室TCMSP数据库(设定“OB≥30%”和“DL≥0.18”为筛选条件)获取FFBM中的主要化学成分，计算各成分的分子离子及其准分子离子的质荷比(m/z)，对“1.6”项下数据进行靶向性的提取，并对其靶标进行预测。

1.8 原发性肝癌靶标收集 以“Primary Liver Cancer”作为关键词，按照相关性得分(Relevance score≥21.610)作为筛选条件，利用GeneCards数据库对PLC的靶标进行筛选。

1.9 PPI网络的构建及核心靶标的筛选 “1.7”项下筛选出的FFBM靶标导入STRING数据库进行不同模式下生物的同源基因映射，转化为人类基因。将转化后的成分靶标与疾病靶标共同导入到韦恩2.1.0中，绘制韦恩图获取两者交集，对FFBM的有效作用靶标进行筛选，同时利用STRING数据库，构建PPI网络(PPI score>0.7)。将筛选后的靶标导入Cytoscape3.6.0软件中进行可视化分析，构建“药物靶标-疾病靶标”相互作用网络。

1.10 KEGG通路富集分析 为进一步明确FFBM与PLC交集靶标具体的功能以及在相关通路中的作用，应用DAVID数据库以人类为研究对象，对核心靶标KEGG通路富集分析，解析FFBM的潜在作用机制。

1.11 分子对接验证 根据FFBM的质谱分析验证结果，结合PPI网络，从中选取degree值排名靠前的6个成分，在Chem Draw Ultra 7.0软件中绘制出6种成分的2D结构，保存为*.mol格式文件，运用Discovery Studio 2016 Client软件使用protocol对配体进行三维结构转化同时加氢、产生异构体；后通过PDB数据库下载6种成分相应靶标蛋白结构的*.pdb格式文件，运用Discovery Studio 2016 Client软件移除靶蛋白中的配体以及非蛋白成分(如水分子等)，对其进行蛋白修饰。将上述两种文件进行LibDock分子对接，以对接打分(LibDock score)评价其相互作用。

2 结果

2.1 FFBM化学成分靶标分析结果 FFBM样品溶液采集得到的UPLC-Q-TOFHRMS基峰图，见图1。按“1.6”项下鉴定得到96种化学成分[7]，结果见表1。基于TCMSP数据库，获取FFBM化学成分作用的靶标，与化合物结构分析鉴定出的96种成分的进行比对，二者合并去除重复值后，共得到化学成分59种，靶标330个。其中鉴定出的成分与核心靶标具有关联性的用“T”表示，关联性不强的用“F”表示。

A：为正离子模式；B：负离子模式。图1 FFBM BPC图

表1 FFBM化学成分鉴定表

(续表)

2.2 原发性肝癌靶标分析结果 基于GeneCards数据库，搜索PLC疾病相关靶标，共得到15 561个靶标，以Relevance score为参数指标，依次取中位数7.766、13.563、21.610进行筛选，最终以Relevance score≥21.610为筛选条件，得到PLC疾病相关靶标1 945个。

2.3 PPI网络的构建及核心靶标的筛选分析结果 “1.9”项下STRING数据库基因映射后共得到290个人类基因靶标，与疾病靶标获取的两者交集共有173个靶标(见图2)。将这173个靶标导入到STRING数据库中进行蛋白质相互作用分析(PPI)，根据PPI得分(>0.7)，初步筛选关键靶标蛋白，然后导入Cytoscape3.7.2中进行蛋白质互作网络构建。

图2 FFBM与原发性肝癌交集靶标

将关注基因导入后，选择其邻居节点，并提取关注基因的子网络，移除网络中节点的自环，通过Network Analyzer插件对网络的拓扑性质进行分析，取degree，betweenness，closeness3个拓扑参数的中位数为阈值(分别为100、0.012 9、0.392 8)进行筛选，最终获得24个相互作用的核心靶标。将核心靶标通过Cluster Maker 2插件进行模块分解和识别，删除连接度为1的模块，见图3、4。图3中核心靶标的节点颜色为蓝色，直观的表明了蛋白与蛋白之间的相互作用，蛋白之间连线越粗，表明相应蛋白之间的相互作用越强[8]。

图3 FFBM与原发性肝癌靶标与靶标的相互作用关系

图4 FFBM核心靶标的PPI

2.4 KEGG通路富集分析结果 基于DAVID数据库对FFBM筛选出的24个核心靶标进行KEGG通路富集分析，根据P<0.05对数据进行筛选，共获得238信号通路，取P值最小的前20条通路进行如下分析，见表2、图5。图5中气泡越大代表该通路所包含的输入基因越多，颜色越红表明富集程度越高，越靠右表明富集因子越高。表2中P值代表该通路与PLC的相关强弱，P值越小代表相关性越强；数量值代表该通路富集的靶标个数，数值越大表明富集的靶标越多。

表2 FFBM关键靶标KEGG通路富集分析

图5 FFBM关键靶标KEGG通路富集分析

根据以上分析结果，将FFBM的化学成分、PLC的潜在作用靶标及其富集得到的信号通路，导入 Cytoscape 3.6.0软件绘制“化合物-靶标-通路”网络，见图 6，其中红色为信号通路，绿色为核心靶标，黄色为FFBM的化学成分，连线代表成分、靶标和信号通路之间的关系。对所得结果进行网络拓扑结构分析，可知有RB1、JUN、AR、RELA、AKT1、CASP3等16个核心蛋白靶标，对应山柰酚、野黄芩苷、高黄芩素、异鼠李素、没食子酸等29个成分，以及Prostate cancer，Pancreatic cancer，TNF signaling pathway，p53 signaling pathway 等 20 条通路。

图6 FFBM化合物-关键靶标-通路

2.5 分子对接分析结果 采用 Discovery Studio 2016 Client软件的LibDock模块,对关键化学成分进行分子对接验证，当LibDock Score大于105分或高于原配体打分值时,认为成分与靶标具有较好的结合活性[9]，取每个靶标评分最高的化合物，结果见表3。结合关键成分多的靶标，产生药效的可能性越大，为关键节点可能性。

表3 FFBM关键成分与对应靶标分子验证

3 讨论

中医认为PLC属中医“臌胀、症瘕、积聚”范畴[10]，《黄帝内经·素问·五脏生成论》记载“肝藏血，心行之，人动则血运于诸经，人静则血归于肝脏。”《灵枢·本神》曰：“肝藏血，血舍魂。”表明PLC病机演变过程与邪气入络客于血脉，影响气、血、津、液的运行及输布有关[11]。FFBM11味药具有破血消瘀，攻毒蚀疮之功效，其中君药斑蝥破血逐瘀、解毒蚀疮，此外其有效成分斑蝥素对于肝癌、胃癌等多种肿瘤具有较强的抑制作用[12]。臣药莪术和三棱相须为用，增强斑蝥化瘀功效的同时还可消积止痛。人参、刺五加二者合用滋补肝肾效果显著，具有抗炎、抗病毒等作用；半枝莲和熊胆粉佐以补养肝肾，抗癌止痛、清热解毒，使药甘草调和诸药[13-15]。赵士冲等[16]研究发现FFBM可通过抑制原癌基因C-Myc的表达和促进抑癌基因p53的表达发挥抗肝癌的作用，但其治疗PLC的分子机制尚不清楚。

本文通过网络药理学借助多个生物信息数据库及分析软件，构建了PPI网络以及“化合物-关键靶标-通路”的网络图探究FFBM对PLC的作用机制。

本研究首先基于高分辨质谱对网络药理学筛选得到的成分进行验证，共验证分析得到59种成分，其中单萜类成分斑蝥素具有诱导细胞凋亡，干扰细胞周期，抑制肿瘤细胞的浸润和转移等作用，是临床上的最佳抗癌药物之一[17]。封艳艳等[18]研究发现斑蝥素可明显促进细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化引起肝癌细胞Hep G2生长抑制，起到抗肝癌的作用。验证得到的成分中包括芹菜素、山奈素、羟基芫花素等24种黄酮类化合物。如芹菜素可通过抑制肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡及分化、抑制肝细胞癌的侵袭和血管生成等而发挥抗癌作用[19]；山奈酚可通过下调miR-21抑制肝癌HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭[20]；羟基芫花素可诱导miR-320a表达，从而抑制转录因子FOXM1和FOXM1下游相关蛋白的表达，抑制肝癌细胞的生长和侵袭[21]。59种成分中黄芩苷、淫羊藿素、异脱水淫羊霍素等16个为苷类成分。其中黄芩苷可阻断癌细胞的细胞周期、促进机体自噬、促进癌细胞凋亡和抑制癌细胞迁移[22]；淫羊藿素具有抗肿瘤、神经保护等多重效应，并且抗肿瘤作用谱广,对多种肿瘤均具有抑制作用，特别是对肝癌有较好的治疗效果[23]，Sun等[24]研究发现淫羊藿素在体外可以抑制肝癌细胞肿瘤球的形成，在体内抑制肝癌肿瘤形成；此外筛选成分中还有异绿原酸B、没食子酸、D-(+)-苹果酸等9个有机酸类成分以及其他类成分9个，这些成分也被报道有一定的抗肝癌活性。

本研究最终筛选出24个核心靶标，16个蛋白靶标，29个主要化学成分以及对应的20条关键信号通路。在得到的16个蛋白靶标中，主要包括RB1、JUN、AR、RELA、AKT1等靶标。其中RB1是细胞周期的负调控因子，是一种抑癌基因，它可通过与转录因子结合调节细胞增殖分化所需基因的表达，从而维持细胞的生长发育平衡[25]。Liu等[26]研究发现miR-1297通过下调抑癌基因RB1参与肝癌的发生。本研究分子对接结果显示，RB1与槐角苷、野黄芩苷、芹菜素、鹰嘴豆芽素A、淫羊藿素、山柰酚、芒柄花苷等均具有较好地结合作用。FFBM可能通过作用于RB1调控癌细胞的增殖分化来治疗PLC。JUN可编码一种蛋白质使其与病毒蛋白高度相似，同时还可以直接与特定靶DNA序列相互作用以调节基因表达[27]。吴林慧等[28]研究发现SPOP蛋白对癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响可能与促进JUN蛋白中的c-Jun的表达有关。AR(雄激素受体)为核受体超家族中的类固醇受体，主要介导雄激素的生物学作用，影响靶蛋白的合成，在多种肿瘤的发生发展及预后中扮演着重要角色。AR对肝癌具有双重作用，一方面它可以促进肝癌的发生几率，另一方面又可以抑制肝癌细胞的转移[29]。Yeh等[30]研究发现AR可作用于HBx、TGF-β1、VEGF、CCRK、miR-216a、p38、NF-κB/MMP9等因子或信号通路，促进肝癌细胞凋亡。本研究分子对接结果显示AR与野黄芩苷、鹰嘴豆芽素A、淫羊藿素、山柰酚、芒柄花苷、异脱水淫羊霍素等具有较好的结合作用。文献研究表明NF-κB家族成员RELA翻译修饰后可精准调控NF-κB的转录活性，而下调NF-κB活性已成为癌症治疗的关键[31]。本研究分子对接结果显示RELA与野黄芩苷具有较好的结合作用。AKT1调控细胞的增殖和生长，参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程。甘彩玉等[32]通过建立BEL-7404肝癌裸鼠移植瘤模型，证实可通过激活细胞凋亡PI3K/AkT/p53信号传导通路,抑制Bcl-2,提高Bax的表达,促进肝癌细胞凋亡。以上关键靶标蛋白与相应成分具有良好的结合活性，从分子对接的角度验证了基于结构相似性验证的网络药理学预测结果。

KEGG通路分析结果表明FFBM治疗PLC的过程主要涉及p53 signaling pathway、TNF signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、T cell receptor signaling pathway等20条信号通路。其中p53信号通路以p53基因为核心，通过调控其相关靶基因的表达，达到阻滞细胞周期，促进肿瘤细胞凋亡的目的。p53基因在激活后表现出明显的抑癌作用，上调p53基因的表达，可以提高p53基因的核内水平，促进其目标基因转录，诱导细胞凋亡[33]。TNF信号通路以TNF-α细胞因子为核心，参与全身炎症反应。孔凡荣[34]发现，肝癌组织中TNF-α的基因表达水平明显低于癌旁组织。Zhu等[35]发现，肿瘤坏死因子TNF-α能够通过瞬时受体电位通道促使Ca2+内流，进一步激活钙蛋白酶/IAP/caspase3信号通路以促进肝癌细胞凋亡。NOD样受体是细胞质PRRs的一个亚群，在宿主先天免疫应答的调节中起关键作用[36]，其中研究热点NOD1和NOD2蛋白在与配体结合后，蛋白可以和下游的RIP2相互作用磷酸化IκB，进一步激活转录因子NF-κB，介导炎症介质的表达[37]。总之，通路富集分析结果表明FFBM抗PLC的复杂作用机制。

综上所述，本文基于液质联用技术分析、网络药理学及分子对接技术对FFBM治疗原发性肝癌的有效成分及其作用机制进行研究，研究结果对于FFBM的质量控制和治疗原发性肝癌的有效活性成分的发现提供依据。