分离自野生猕猴桃的酿酒酵母A12-2和BL20对猕猴桃酒品质的影响

朱 静，杨晓聪，陈亚蓝，王闪闪

（信阳农林学院食品学院，河南信阳 464000）

猕猴桃营养丰富[1]，市场接受度高，有广阔的市 场应用前景。目前，我国猕猴桃的种植面积位于世界第1位，年产量居世界第4位，主要分布在河南、陕西秦岭区域等区域[2]，猕猴桃销售方式以鲜销为主，然而由于贮藏技术有限，导致大量次果鲜销困难[3]，因此，加大果实加工产品的开发，对于猕猴桃资源的利用有很大的意义和前景[4]。目前针对猕猴桃的加工产品主要涉及果汁、果酒、果干、果脯、果酱、果糕等[2,5]，其中果酒具有加工利用率高，风味独特，营养价值高[6]，市场前景广阔的特点。酿造果酒的质量主要与酿造时选用的酵母品种有关，采用普通酵母酿造的猕猴桃果酒发酵性差[7-8]，因此，较多的研究集中在猕猴桃酿酒酵母品种的分离纯化和选育[4,9]上，而关于猕猴桃酿酒酵母在酿造工艺及其工艺参数优化[9]和野生猕猴桃酵母菌种与商用酵母特性对比的研究较少。已报道分离纯化的猕猴桃酿酒酵母主要有菌株1-21和1-31[9]、野生酵母JM11[10]、菌株Q3[11]以及菌株GT-1、GT-2等[12]，但上述酵母酿造的果酒还存在色泽较浅、VC和酒精产量低、发酵效果并不理想等问题。

本试验以前期从大别山区野生猕猴桃中分离的专用酵母 A12-2和 BL20（以下简称 A12-2、BL20）为研究对象，与商用酵母：安琪果酒专用酵母RW、安琪酵母RV002（以下简称RW、RV002）对比，通过测定发酵过程中的总酸、酒精度、糖度、pH、VC、挥发性香气成分，并进行感官评价，阐述A12-2和BL20的发酵特性及其对产品品质的影响，为野生猕猴桃专用酵母和猕猴桃果酒的开发提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

安琪果酒专用酵母RW、安琪酵母RV002 安琪酵母股份有限公司；野生猕猴桃酿酒酵母BL20和A12-2 信阳农林学院微生物实验室保藏；野生猕猴桃 信阳商城大别山山脉采摘；白砂糖 购自当地西亚超市；偏重亚硫酸钾（食品级） 河南禾兴生物科技有限公司；柠檬酸（食品级） 广东康达生物科技有限公司；葡萄糖、琼脂粉、氢氧化钠、抗坏血酸、碳酸氢钠（分析纯） 天津市科密欧化学试剂有限公司；可溶性淀粉（分析纯） 天津市巴斯夫化工有限公司；YEPD培养基 参照蒋成等[11]的方法配制。

HH-6电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；STARTER3C pH计 奥豪斯仪器（上海）有限公司；LDZM-60KCS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；ZHJH-C1112C智城超净工作台、ZWY-2112B恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；SPX-250生化培养箱 北京科伟永兴仪器有限公司；HW远红外干燥箱 北京科伟永兴仪器有限公司；TG16台式高速离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；GC9800气相色谱仪 上海科创色谱仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酵母扩大化培养流程 实验室保藏的酵母菌菌种→菌种活化→菌种扩大培养→菌种的检验→菌液离心→湿菌体

1.2.2 菌种扩大化培养操作要点 菌种活化：按郝爱玲等[13]的方法，将-80 ℃甘油保藏的酵母菌涂布接种 100 μL于YEPD平板上，30 ℃ 恒温培养 2～3 d。

菌种扩大培养：挑取活化的单菌落接种于5 mL YPD试管中，30 ℃ 165 r/min培养过夜，即种子液。以5%的接种量，将种子液接种于150 mL YPD三角瓶中，同条件下培养48 h。

酵母菌种的检验：用接种环挑取1环的菌液，制成水浸片，在显微镜下观察，检测菌体是否纯净。

菌液离心：在超净工作台中，将菌液倒入灭菌的离心管中，4000 r/min离心15 min，倒掉上清液，反复多次，至全部离心结束，将无菌水倒入带有酵母菌沉淀的离心管，8000 r/min离心10 min，重复2～3次，弃去清液得湿菌体。

1.2.3 猕猴桃果酒发酵工艺 新鲜的猕猴桃清洗去皮，切碎打浆，加蔗糖调节糖度到20°Brix。将偏重亚硫酸钾（60 mg/L）溶于经灭菌（75%酒精）过的含有10 mL水的广口瓶中，加入打浆好的猕猴桃汁液，加果胶酶（100 mg/L），50℃水浴脱胶4 h，加入柠檬酸将pH调至3.50，按1 g/L接种1.2.2中的湿菌体，22 ℃前发酵6 d，双层纱布过滤，18 ℃后发酵6 d，用500 mg/L皂土（50 ℃热水活化后使用）澄清，换罐、去除沉淀，15 ℃陈酿后，双层纱布过滤后采用0.45 μm滤膜过滤除菌，即获得成品猕猴桃果酒[14-15]。

1.2.4 理化指标测定 总酸的测定采用国标GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中指示剂法测定；可溶性固形物的测定参考Wei等[16]进行；还原糖的测定采用斐林法[17]；VC的测定采用国标GB5009.86-2016《食品中抗坏血酸的测定》中2,6-二氯靛酚滴定法；pH的测定采用国标GB/T15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中pH计法；酒精度的测定采用国标GB5009.225-2016《酒中乙醇浓度测定》中酒精计法。

1.2.5 成品的挥发性香气成分 采用气相色谱法，参照朱静[18]、琪安等[19]方法进行部分挥发性物质分析。

1.2.5.1 样品处理 检测时取2 mL待测样放入5 mL顶空瓶中，每毫升样品中加入20 μL内标（50 g/L 4-甲基-2-戊醇的丙酮溶液）终浓度为9.8 mmol/L，在60 ℃下保温处理30 min，使气液平衡，然后用500 μL微量进样器在距液面0.3 mm处吸取300 μL顶空瓶上层气体，注入气相色谱仪（GC-17A/FID，SHIMADZU，日本）中，检测挥发性化合物的残留量。

1.2.5.2 色谱条件 色谱柱为弹性石英毛细管柱DB-WAX-10（φ0.53 mm×30 m），载气 N2，进样量300 μL；采取程序升温，设初始温度为 55 ℃，在 55 ℃下保持 3 min；然后 15 ℃/min 升至 200 ℃，在 200 ℃保持3 min。

1.2.5.3 挥发物化合物含量的计算方法 对照内标浓度和峰面积，计算对照样品和处理样品中挥发性化合物无浓度，按照式（1）计算高级醇降解量。

式中：9.8 为内标的终浓度（mmol/L），A样为处理样品中的挥发性化合物峰面积，A内为内标的峰面积。1.2.6 感官评价 由10位经验丰富，具有专业知识的人员组成感官评定小组进行感官评定。猕猴桃酒的感官评定标准见表1，参照国标GB/T15038-2006葡萄糖、果酒通用分析方法和胡小琴等[19]的方法。

表1 猕猴桃酒感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standard for kiwi fruit wine

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母在发酵过程中对猕猴桃果酒总酸的影响

总酸（以酒石酸计）作为猕猴桃果酒发酵中的一个重要指标，对猕猴桃果酒口感及风味具有重要影响。由表2可知，四种酵母菌发酵猕猴桃果酒总酸含量整体先上升后逐渐趋于平缓。1～9 d四种酵母均呈现上升趋势，主要原因是果酒带渣发酵，原材料中存在的乳酸菌、酵母菌利用糖产生乳酸[20-21]，且发酵过程中酵母细胞通过EMP和HMP途径将葡萄糖降解为丙酮酸、乳酸、柠檬酸等一些有机酸[22-24]，导致总酸含量增加。6 d时A12-2和BL20总酸含量高于两种商用酵母，两种野生猕猴桃酿酒酵母之间总酸含量差异较小，A12-2的总酸含量最高为17.23 g/L。9～12 d四种酵母总酸含量呈较平稳状态，原因可能是发酵后期发酵液中的糖分几乎耗尽，故酸度渐趋于平稳。发酵终止时的总酸含量为：RV002升至最高，为18.86 g/L；RW 次之，为18.47 g/L；A12-2 为18.17 g/L，BL20为18.16 g/L，总酸含量从高到低依次排序为RV002＞RW＞A12-2＞BL20。

表2 前发酵和后发酵总酸含量变化Table 2 Content of total acid during pre-fermentation and post-fermentation

2.2 酿酒酵母在发酵过程中对猕猴桃果酒可溶性固形物的影响

猕猴桃果酒中可溶性固形物可以反映酵母菌的生长繁殖情况及耗糖能力。由表3可知，添加A12-2、BL20和安琪RW、RV002的样品在前发酵1～3 d的可溶性固形物含量急剧下降，而添加酵母A12-2的样品比安琪酵母下降趋势更大，之后降低趋势明显放缓至基本保持不变。主要是酵母菌生长繁殖需要大量的糖类，其会分解糖类，导致可溶性糖类含量急剧下降，后期因为无氧环境以及营养物质消耗殆尽，酵母菌大量死亡，分解糖的能力降低[25]。

表3 前发酵和后发酵可溶性固形物含量变化Table 3 Content of soluble solid state material during pre-fermentation and post-fermentation

从下降趋势来看，酵母A12-2样品的可溶性固形物含量下降速率最快，3 d时A12-2可溶性固形物含量降至最低为7.16°Brix，说明酵母A12-2分解糖的能力较其他酵母更好，更适宜作为发酵菌种使用。后发酵阶段，BL20和RW酿造的猕猴桃果酒可溶性固形物含量均降至8.5°Brix，A12-2和RV002可溶性固形物含量降至8.0°Brix，发酵终止时可溶性固形物含量从低到高依次排序为A12-2=RV002＜BL20=RW。研究显示，酵母菌降糖的速度与酵母菌利用糖转化为酒精的速度即酵母菌发酵能力密切相关[26]。综上可知，A12-2和RV002的发酵能力较强，BL20和RW次之。

2.3 酿酒酵母在发酵过程中对猕猴桃果酒还原糖的影响

还原糖的含量也是衡量果酒发酵进程的一个重要参数，由表4可知，四种酿酒酵母酿造的猕猴桃果酒中还原糖在1～7 d时均呈下降趋势，7～12 d，随着发酵时间的延长，四种酵母酿酒中还原糖的下降趋势明显放缓。可能的原因是前期酵母发酵消耗了大量还原糖，后期酵母数量减少，因此对还原糖的利用降低。发酵中止时，四种酵母酿酒中还原糖的含量分别为：BL20为 6.35 g/L，A12-2为 6.43 g/L，RV002为6.91 g/L，RW为6.61 g/L，从高到低排序为：RV002＞RW＞AI2-2＞BL20。

表4 前发酵和后发酵还原糖含量变化Table 4 Content of reducing sugar during pre-fermentation and post-fermentation

2.4 酿酒酵母在发酵过程中对猕猴桃果酒VC的影响

由表5可知，在1～12 d时，四种酵母菌酿造的猕猴桃果酒中VC含量均呈下降趋势，可能原因是发酵时温度升高以及有氧和无氧呼吸导致酒样中的VC被氧化分解，A12-2和BL20酿造果酒VC含量无明显差异，下降幅度较为平缓，且整体高于两种商用酵母的VC含量，两种商用酵母下降幅度较大、VC含量较低。12 d时，四种酒样VC含量均降至最低：BL20为95.40 g/L，A12-2为 87.90 g/L，RV002为85.20 g/L，RW最低，为77.40 g/L。四种酵母酿酒中VC含量从高到低依次排序为BL20＞A12-2＞RV002＞RW，其中BL20酿造的猕猴桃果酒中VC含量最高，RW酿造的猕猴桃果酒中VC含量最低，酵母BL20较适合酿造猕猴桃果酒。

表5 前发酵和后发酵VC含量变化Table 5 Content of VC during pre-fermentation and post-fermentation

2.5 酿酒酵母在发酵过程中对猕猴桃果酒pH的影响

有机酸含量与果酒的感官品质密切相关，对果酒的口味、风味、香气等有重要影响。果酒中的有机酸包括乳酸、乙酸、醋酸、柠檬酸、苹果酸以及其他酸类物质，有机酸的含量可通过pH反映。

由表6可知，四种酵母酿造的猕猴桃果酒的pH在前发酵过程整体无较大幅度变化，商用酵母相比于野生猕猴桃酿酒酵母波动较小。2 d时两种野生猕猴桃果酒pH呈下降趋势，速度较快；3 d时BL20 pH降至 3.44；4 d时 A12-2 pH降至 3.42，3～8 d时，pH下降的原因一是酵母菌发酵主要产生酒精，二是带渣发酵中其他微生物代谢产生乙酸、乳酸、醋酸和少量二氧化碳等有机酸，三是葡萄糖酵解的一系列中间产物也呈酸性[21]。由表6可知，在8 d至后发酵结束，pH呈上升趋势且变化较为平缓、差异较小，是因为随着发酵时间的推移，生成的有机酸和乙醇被利用发生酯化反应，生成酯类物质，使有机酸含量下降[27]。12 d时，BL20的pH最大，为3.72，从高到低依次排序为 BL20＞A12-2＞RW＞RV002。

表6 前发酵和后发酵pH变化Table 6 Content of pH during pre-fermentation and post-fermentation

2.6 酿酒酵母在发酵过程中对猕猴桃果酒酒精度的影响

果酒发酵过程复杂，发酵期间原料果浆中的糖被酵解为酒精[28]，支撑起果酒的香气和风味，使果酒风味醇厚，具有结构感。

由表7可知，各菌种达到最高酒精度的时间大概是第9～12 d，在3～8 d酒精度会大幅度提升，因为酵母菌大量繁殖后开始进行无氧呼吸，糖被分解成酒精、二氧化碳和其他产物[29]。4种酵母菌的最终（12 d）酒精度从高到底依次为 A12-2＞BL20＞安琪 RW＞安琪 RV002（A12-2为 13.80%vol，BL20为13.70%vol、安琪 RW为13.00%vol、安琪 RV002为12.00%vol），但酵母菌 A12-2 在 1～10 d，酒精生成量总体高于BL2，在2～4 d期间 BL20上升最快，6 d时A12-2上升幅度最大为12.6%vol，说明酵母A12-2产酒精迅速，产酒能力较好。作为一株优良的酿酒菌种，能在短时间内达到一定产酒量是一项重要的性能，所以从产酒力来说达到某个所需酒精度（一般果酒酒精度在9%vol～12%vol）的时间越短越好。

表7 前发酵和后发酵酒精度含量变化Table 7 Content of alcohol in pre-fermentation and post-fermentation

由表7可知，8～12 d酒精含量趋于平缓，主要原因是发酵后期酒精含量高抑制酵母菌发酵，且后发酵阶段发生的酯化反应中酒精被消耗，故发酵趋于平缓[23]。

2.7 挥发性香气成分分析结果

猕猴桃酒中的香气物质包括：酯类、醇类、萜烯类、酸类及醛酮类等[30]，高级醇是酵母通过Ehrlich途径将氨基酸或糖代谢生成[31]，苯乙醇、异戊醇和己醇的含量范围为140.92～536.57 μg/mL，己醇具有水果香味，丁酸乙酯和己酸乙酯散发出水果味和甜味[32]。课题组主要研究正己醇等高级醇及其酯类的转化，测定以下主要挥发性物质，为后期酒的品质改良奠定基础。四种酒的气相色谱图见图1。

图1 发酵猕猴桃果酒状态图Fig.1 State diagram of fermentation kiwi fruit wine

由表8可知，四种酵母菌株酿造的猕猴桃果酒挥发性香气成分均有己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯、己醇等。四种酵母菌酿制的猕猴桃果酒所测五种挥发性物质含量分别为25.13、34.21、14.62和23.33 mg/L，从高到低依次排序为BL20＞A12-2＞RV002＞ RW。四种不同酵母的挥发性香气成分含量存在一定的差异，BL20酿造的猕猴桃果酒中这五种挥发性香气物质含量最高，RW酿造的猕猴桃果酒中挥发性香气物质含量最低。而BL20含量最高的香气成分为丁酸乙酯，且为猕猴桃果酒典型性香气成分。根据周元等[33]的研究，己酸乙酯具有水果甜香味，丁酸乙酯具有梨、花香，乙酸丁酯有强烈的水果香气、具先辣后甜似菠萝味道，乳酸乙酯具有优雅的气味，正己醇具有水果芳香，进一步说明BL20酿造的猕猴桃果酒香味最为浓郁。综上所述，BL20酿造的猕猴桃果酒风味最佳。

表8 酿酒酵母酿造的猕猴桃果酒部分香气成分Table 8 Part aroma components of kiwi fruit wine brewed by two kinds of Saccharomyces cerevisiae

2.8 酿酒酵母对猕猴桃果酒感官评分的影响对比

由表9及图1可知，BL20酿造的猕猴桃果酒感官评分最高为86分，其酒样澄清透明，色泽透亮，香味最浓郁，酒体较醇厚具有典型性，品质最佳。

表9 猕猴桃酒感官评价Table 9 Sensory evaluation of kiwi fruit wine

3 讨论与结论

本文以野生猕猴桃果酒的总酸、糖度、VC、pH、酒精度、挥发性香气物质含量为指标，通过对比前期实验室保藏的野生猕猴桃酿酒酵母A12-2、BL20和普通商用酵母：安琪果酒专用酵母RW、安琪酵母RV002酿造猕猴桃果酒的品质差异，说明野生猕猴桃酿酒酵母的发酵特性及对猕猴桃果酒品质的影响。本文四种酵母酿造的猕猴桃果酒总酸含量均＞18 g/L，酵母RV002较马佳佳等[22]采用徐香猕猴桃酿造果酒的总酸值高（10.3 g/L），可能是采用的猕猴桃原料不同、菌种不同等因素造成；本文四种酵母可溶性固形物至12 d时含量＞8.0°Brix，还原糖含量＜7 g/L。与周元等[33]研究相比，分解糖的能力较弱、耗糖速率略慢，后者在第9 d时可溶性固形物可降低到6～7°Brix，其起始可溶性固形物含量为 18°Brix，本文调节初始可溶性固形物含量为20°Brix。与黎星辰等[25]研究相比，分解糖的能力相当；本文酿酒酵母BL20酿造的猕猴桃果酒VC含量为95.4 g/L，与马荣山等[34]研究结果相比VC含量较低；本文四种酵母所酿猕猴桃酒的pH约3.6，与李影等[23]的研究相比偏低；采用A12-2和BL20酿造的猕猴桃酒的酒精度分别为13.8%vol和13.7%vol，与黎星辰等[35]的研究相比酒较高，但均在0%vol～14%vol范围内，说明前期筛选的A12-2和BL20产酒精能力较好；BL20酿酒酵母酿造的猕猴桃酒正己酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丁酯、乳酸乙酯和正己醇含量分别为1.80、28.5、0.25、2.00和1.66 mg/L；BL20酿造的猕猴桃果酒感官评分最高为86分，品质最佳。