喹啉铜在柑橘中的储藏稳定性、消解动态及膳食暴露风险评估

陈显柳，王素茹，陈博钰，谢德芳

（中国热带农业科学院分析测试中心，国家市场监管重点实验室（热带果蔬质量与安全），农业农村部亚热带果品蔬菜质量安全控制重点实验室，海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室，海南海口 571101）

喹啉铜是一种广谱、高效、低残留的喹啉类保护性低毒杀菌剂，属有机铜鳌合物。喹啉铜喷施后可在植物表面形成一层严密的保护药膜，药膜缓慢释放铜离子，铜离子被病菌萌发的孢子吸收，达到一定浓度时，可杀死孢子细胞，起到杀菌作用，从而有效抑制病菌的萌发和侵入[1-2]。喹啉铜广谱高效，同时具有喹啉和铜盐的作用，因而在我国柑橘种植过程得到广泛的应用[3]。但是如果过量使用喹啉铜，不仅会造成环境污染，还会导致铜离子在生物体内富集，进而对人体健康产生威胁[4]。Wang等[5]研究表明当喹啉铜超过一定剂量浓度时，会导致环境中斑马鱼胚胎发育缺陷的概率增加和行为发生改变。我国已经制定了苹果、葡萄、杨梅、荔枝中喹啉铜的最大残留限量，但尚未制定柑橘中喹啉铜的最大残留限量[6]。

目前检测农产品中喹啉铜残留量的方法主要有液相色谱法[7-9]、气相色谱法[10-11]和液相色谱质谱串联法[12]。徐小军等[7]采用高效液相色谱法研究了喹啉铜在枇杷中的消解动态，其半衰期为3.4～4.6 d。Li等[1]采用高效液相色谱法研究了喹啉铜在梨中的残留及消解动态，其半衰期为6.8～9.7 d。郑振山等[12]采用高效液相色谱-串联质谱法研究了喹啉铜在马铃薯中的残留及消解动态，其半衰期为8.89～11.1 d，最终残留量均小于0.10 mg/kg。常培培等[8]使用超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器研究了喹啉铜在西瓜和土壤中残留及消解动态，其半衰期为1.1～2.3 d。柑橘是世界第一大类水果，柑橘皮经过干燥处理后可制成陈皮作为中药使用，是老百姓餐桌上常见的水果，其食用的安全性备受关注[13-14]。目前，国内外关于喹啉铜在柑橘中的残留及消解动态研究较少[15]，未见33.5%喹啉铜悬浮剂在柑橘中残留、消解动态及膳食暴露风险的研究报道。同时柑橘样品基质复杂，储藏过程中可能影响到喹啉铜的降解[16]。因此研究喹啉铜在柑橘中的储藏稳定性、消解动态及膳食暴露风险评估具有重要意义。

本研究通过高效液相色谱法测定柑橘中喹啉铜的残留量，通过对海南、江西两地田间试验样品的检测分析，评估了柑橘中喹啉铜的储藏稳定性、消解动态及膳食暴露风险，为规范33.5%喹啉铜悬浮剂在柑橘生产中的安全使用提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

喹啉铜标准品 质量100 mg，纯度99.8%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；33.5%喹啉铜悬浮剂 质量分数33.5%，浙江天丰生物科学有限公司；乙腈 色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司；三氟乙酸色谱纯，阿拉丁试剂上海有限公司；石墨化炭黑填料（GCB） 上海安谱科学仪器有限公司；氯化钠分析纯，西陇科学股份有限公司。

Waters e2695高效液相色谱仪（配有2489紫外检测器） 美国沃特世公司；CR22N高速离心机 日本HITACHI公司；Milli-Q超纯水器 德国Millipore公司；HT-200高速振荡仪 北京优晟联合科技有限公司；TTL-DCII氮吹仪 北京同泰联科技发展有限公司；KQ-250DE超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；XW-80A微型旋涡混合仪 上海驰唐电子有限公司；L204电子天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 称取5.00 g柑橘全果或果肉样品于50 mL离心管中，加入3 g氯化钠，10 mL 0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈的混合溶液（v:v=1:9），涡旋5 min，150 W 超声20 min，3800 r/min 离心5 min，重复提取步骤，合并上清液[9]。取5 mL上清液于10 mL离心管中，加入5 mg GCB填料净化，涡旋2 min，3800 r/min离心5 min，取4 mL上清液于旋转蒸发瓶中，旋转蒸发至近干，用0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈的混合溶液（v:v=1:9）定容至1 mL。经0.22 μm水相滤膜过滤，供高效液相色谱法测定样品中喹啉铜的质量浓度，由外标法进行定性定量。

1.2.2 仪器条件 色谱柱：SunFire®C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm），流动相：0.1% 三氟乙酸水溶液和乙腈，柱温 25 ℃，进样量 10 μL，流速 1.0 mL/min，等梯度洗脱 v（0.1% 三氟乙酸水）:v（乙腈）=9:1，检测波长254 nm。

1.2.3 添加回收试验设计 在柑橘全果和果肉的空白样品中设立喹啉铜质量分数为0.2、2、5 mg/kg的添加水平，每个添加水平设5个平行，同时设空白对照，按照1.2.1方法进行样品前处理，在以上仪器条件下，通过高效液相色谱法测定质量浓度，并计算回收率。

1.2.4 储藏稳定性试验设计 按照植物源性农产品中农药残留储藏稳定性试验准则[17]，进行喹啉铜在柑橘中的储藏稳定性试验，取样分析时间为0、30、60、90、180 d。称取5.00 g柑橘全果空白样品于50 mL聚四氟乙烯离心管中，往样品中添加喹啉铜，质量分数均为2 mg/kg，共10个试验样品，于2 h内储藏于-20 ℃冰柜内。每次取样测定储藏稳定性试验样品2个、柑橘全果空白对照样品1个、添加水平为5 mg/kg的柑橘全果质控样品2个，通过1.2.1的分析方法测定试验样品中的喹啉铜质量浓度。根据式（1）计算柑橘全果样品储藏过程中喹啉铜残留的降解率[17]。

式中：C为1.2.3中试验样品喹啉铜的初始残留量（mg/kg）；Ci为样品保存i天后，样品中喹啉铜的残留量（mg/kg）；Di为样品保存i天后，样品中喹啉铜降解率（%）。当Di＜30%，表明农药在样品中储藏i天稳定，反之，则不稳定。

1.2.5 田间试验设计 按照农作物中农药残留试验准则[18]及田间试验[19]要求，于2019年在海南省和江西省进行了喹啉铜在柑橘中的规范残留试验。每个地区的试验点设试验小区和对照小区各1个，试验小区前后未施用过相同的农药，每个小区有4株柑橘树，小区之间设有隔离区，周边设有保护行。试验小区柑橘树全株喷雾施药33.5%喹啉铜悬浮剂3次，施药剂量为 333.3 mg a.i./kg（1000 倍液），施药间隔7 d。对照小区喷施清水。最终残留试验样品于最后一次施药后20、30 d采集，残留消解试验样品于最后一次施药后 2 h（0 d）、3、7、14、20、30 d 采集，空白小区样品于0、30 d采集。每次采集独立样品2份，每份样品随机至少采集2 kg生长正常、无病害的柑橘果实，采集部位遍及树体上中下部。样品采收后沿纵向均匀地切成4瓣，分取不相邻的2瓣，直接进行匀浆，制备成柑橘全果样品；或者去除橘皮后进行匀浆，制备成柑橘果肉样品。

1.2.6 半衰期 采用一级动力学方程模型对残留消解试验中获得的柑橘中喹啉铜残留量进行分析拟合。喹啉铜在柑橘中的降解方程和半衰期[20-21]按照式（2）、式（3）进行计算：

式中：Ct为时间t时的喹啉铜残留量（mg/kg）；C0为残留消解试验0 d样品中喹啉铜的初始残留量（mg/kg）；k 为降解速率常数；T1/2为半衰期（D）。

1.2.7 慢性膳食暴露风险评估 根据规范残留试验中值和我国人群每人每天的柑橘消费量计算喹啉铜的估算每日摄入量（estimated daily intake，EDI）（μg/kg·bw）。根据EDI与喹啉铜的每日允许摄入量（acceptable daily intake，ADI）的百分比得到喹啉铜的慢性膳食暴露风险概率（risk quotiety，RQ）（%）。计算公式如下[22-23]：

式中：STMR为喹啉铜在柑橘中的规范农作物残留试验中值（supervised trials median residue，STMR）（mg/kg）；FI为我国不同人群每人每天的柑橘消费量（food intake，FI）（g/d），数据来源于《中国居民营养与健康状况调查报告》[24]；bw为我国普通人群的平均体重（body weight，bw）（kg）；ADI为喹啉铜每日允许摄入量（mg/kg·bw），我国规定喹啉铜的ADI为0.02 mg/kg bw[6]。当RQ的值≤100%时，表示对普通人群健康产生的风险在可接受范围之内，数值越小，风险越低；当RQ的值＞100%时，表示风险在不可接受范围，数值越大，风险越大。

1.3 数据处理

每个样品平行处理3次，采用Waters公司的液相色谱分析工作站Empower 3进行数据处理，通过Excel 2016进行均值、标准差和相对标准偏差计算，通过Origin 2018进行一级动力学拟合并绘图。

2 结果与分析

2.1 方法学考察结果

喹啉铜标准品用流动相稀释并配制成0.1、0.2、0.5、1.0、5.0 μg/mL的系列标准工作液，在以上的仪器条件下，通过高效液相色谱法进行测定。以喹啉铜质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。结果表明：在0.1～5.0 μg/mL的范围内，其线性方程为 y=125038x+1513，决定系数R2为0.9999，线性关系良好。在1.2.1的前处理及仪器条件下，以检测器上的3倍信噪比对应的质量浓度确定喹啉铜的检出限（limit of detection，LOD）为 1 ng；喹啉铜在柑橘全果和果肉中的最低检测浓度均为0.2 mg/kg，因此方法的定量限（limit of quantitation，LOQ）为0.2 mg/kg。添加回收试验结果如表1所示：在柑橘全果中，喹啉铜的平均回收率为89.3%～98.7%，相对标准偏差（RSD）为 1.9%～3.7%；在柑橘果肉中，喹啉铜的平均回收率为92.6%～102.2%，相对标准偏差（RSD）为2.8%～5.5%。方法的准确度和精密度符合《农作物中农药残留试验准则》[18]规定的残留分析方法要求。标准品及样品谱图见图1。

图1 喹啉铜标准样品、空白样品及添加样品色谱图Fig.1 Chromatogram of oxine-copper standard solution, blank citrus samples and spiked Citrus samples

表1 喹啉铜在柑橘全果、果肉中的添加回收率和相对标准偏差（n=5）Table 1 Recoveries and relative standard deviations of oxine-copper in Citrus whole fruit and pulp (n=5)

2.2 喹啉铜在柑橘中的储藏稳定性

由表2可以看出，喹啉铜添加水平为2 mg/kg的柑橘全果样品随着储藏时间的增加，残留量变化不大，降解速度缓慢。质控样品的回收率为97.4%～103.9%，整个储藏试验期间喹啉铜的降解率为0～8.0%，未超过植物源性农产品中农药残留储藏稳定性试验准则[17]规定的30%，因此喹啉铜在上述条件下，可以在柑橘中稳定存在180 d以上。

表2 喹啉铜在柑橘全果样品中的储藏稳定性（添加水平2 mg/kg）Table 2 Storage stability of oxine-copper in Citrus whole fruit(spiked level 2 mg/kg)

2.3 消解动态

由图2可知，在江西和海南试验地的柑橘全果样品中，当天施药后2 h，喹啉铜的原始沉积量分别为1.40和1.32 mg/kg。江西地样品的初始沉积量高于海南地样品，可能与施药时风速、器械和施药操作的差异有关，同时不同地点作物的生长状况也会影响喹啉铜在柑橘上的附着量[25]。随着时间的延长，样品中的喹啉铜残留量逐渐降低，施药30 d后，江西地样品中喹啉铜残留量为0.32 mg/kg，降解率为77%，海南地样品中喹啉铜残留量低于LOQ，降解率超过85%。两地柑橘全果样品中喹啉铜的消解动态均符合一级动力学方程：江西为Ct=1.33805e-0.046t，海南为 Ct=1.04925e-0.068t；决定系数（R2）分别为 0.9746和0.8694；半衰期分别为15.1 d和10.2 d，属于易降解农药（T1/2＜30 d）。海南试验地柑橘中喹啉铜的降解速率更快，半衰期更短，这可能主要与试验期间海南试验地相比江西试验地的光照更强时间更长，温度更高，降雨更频繁有关。柑橘中喹啉铜的残留消解趋势残留见图2。消解试验中柑橘果肉样品中喹啉铜残留量均低于定量限。

图2 喹啉铜在柑橘全果样品中的残留消解趋势Fig.2 Digestion curves of oxine-copper in whole fruit of Citrus samples

2.4 慢性膳食暴露风险评估

根据最终残留试验设计，对柑橘喷施喹啉铜3次，末次施药后20、30 d采集样品进行测定柑橘全果、果肉中喹啉铜残留量，见表3。结果表明柑橘全果样品药后20和30 d的残留试验中值（STMR）分别为0.42和0.25 mg/kg；柑橘果肉样品中均未检出喹啉铜残留，其残留试验中值（STMR）按照LOQ（0.2 mg/kg）计算。不同年龄段人群的平均体重和水果消费量来自《中国居民营养和健康状况调查报告》[24]。慢性膳食暴露风险评估结果见表4。结果表明，药后20和30 d柑橘全果样品中喹啉铜的估算每日摄入量分别为 0.1872～1.4584 μg/kg·bw 和 0.1114～0.8681 μg/kg·bw，慢性膳食暴露风险概率分别为0.94%～7.29%和0.56%～4.34%；柑橘果肉中喹啉铜的估算每日摄入量为 0.0891～0.6945 μg/kg·bw，慢性膳食暴露风险概率为0.45%～3.47%。在柑橘上规范使用33.5%喹啉铜悬浮剂，对一般人群健康不会产生不可接受的风险。虽然柑橘全果和果肉中的喹啉铜在不同人群中的慢性膳食暴露风险总体水平较低，但是由于体重较轻的缘故，儿童的风险水平要高于其他人群。

表3 喹啉铜在柑橘中的最终残留Table 3 Final residue levels of oxine-copper in Citrus

表4 不同人群中喹啉铜的慢性膳食暴露风险评估Table 4 Dietary exposure risk assessment of oxine-copper in different populations

3 结论

在-20 ℃的条件下储藏180 d，柑橘全果样品中喹啉铜的降解率低于10%，因此喹啉铜可以稳定存在柑橘果实中。同时在海南和江西两地进行规范残留试验，柑橘树全株喷雾施药33.5%喹啉铜悬浮剂3次，施药剂量为 333.3 mg a.i./kg（1000 倍液），施药间隔7 d，柑橘中喹啉铜的残留量随着时间的延长逐渐降低，其消解符合一级动力学方程，半衰期为10.2～15.1 d。根据规范残留试验中值与膳食摄入量进行慢性膳食暴露风险评估，结果表明，在柑橘上规范使用33.5%喹啉铜悬浮剂，我国不同人群柑橘中喹啉铜估算每日摄入量为 0.0891～1.4584 μg/kg·bw，其慢性膳食暴露风险小于10%，在可接受范围内，处于安全水平。