丹参酚酸A对脑缺血大鼠神经功能及热休克蛋白基因表达的影响

周丽娜，辛 欢，杨 敏，方 芳，张 艺

(武汉市第一医院 武汉市中西医结合医院，湖北 武汉 430030)

再灌注损伤为导致缺血性脑卒中病情加重甚至死亡的重要原因，其发生与炎性反应、兴奋性氨基酸、钙超载以及氧自由基生成关系密切[1]。故而临床通常使用抗炎、抑制血小板聚集以及降血脂等药物对脑缺血再灌注损伤进行治疗[2]。中医学将缺血性脑卒中再灌注损伤归为“中风病”的诊疗范畴，中医学认为本病的病机主要为风、火、痰、瘀、气、虚六端，致瘀血阻于脑络，发为本病，故治疗中常以“活血通络”为治疗原则，治疗效果常较为理想[3]。丹参酚酸A提取自具有“活血通络”作用的中药丹参，其不仅具有抗血小板聚集的作用，同时具有抗动脉粥样硬化的作用，在缺血性脑卒中再灌注损伤的治疗中具有良好的应用效果[4]。热休克蛋白(HSP)是因缺血、缺氧、损伤等应激刺激而诱导产生的应激性蛋白，HSP70为HSP中最主要的一种[5]。脑缺血以后机体会产生相应的应激反应，进而促进HSP70在脑中的分布和表达，另外，HSP70还具有脑细胞保护功效，可以增强脑细胞对缺氧、缺血的耐受性，降低致死性的损伤[6]。目前临床上对于丹参酚酸A干预缺血再灌注损伤的作用机制尚未清楚。有研究显示，丹参酚酸A具有抑制炎症反应的作用，进而对相关症状进行缓解[7]。有研究认为，丹参酚酸A可降低脑卒中患者炎症反应以及血液黏度，改善患者相关症状[8]。也有研究显示[9]，丹参酚酸A可对HSP的表达产生影响。故本文探讨丹参酚酸A对脑缺血大鼠神经功能及热休克蛋白基因表达的影响，试探讨其脑保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取80只健康清洁级成年雄性SD大鼠，体重200～220 g，自由摄食饮水，购于南京君科生物工程有限公司。

1.2 实验仪器及试剂 低温高速离心机(Eppendorf 5427 R)购于Eppendorf 中国有限公司；紫外分光光度计(DR6000)购于HACH；酶联免疫吸附仪(M266494)购于北京若水合科技有限公司；恒温培养箱(ZHS-100 M)购于上海喆图科学仪器有限公司；轮转式石蜡切片机(ERM3000)购于常州市郝思琳医用仪器有限公司；高压蒸汽消毒锅(LS-50 HD)购于滨江医疗。胶质源性神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购于南京建成生物技术公司；氯化三苯四氮唑(TTC)购于美国Sigma公司；HSP-70抗体试剂盒、HSP-70 mRNA原位杂交检测试剂盒购于北京百奥莱博科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及造模方法[10]：选用80只健康成年雄性SD大鼠作为研究对象，通过线栓法制备动脉缺血再灌注损伤模型，按照随机数字表法将其分为假手术组、模型组、低剂量组(10 mg/kg丹参酚酸A)和高剂量组(30 mg/kg丹参酚酸A)四组，每组20只。采用45 mg/kg的戊巴比妥钠(2%)对大鼠进行腹腔麻醉，在其颈部正中位置进行切口处理，将颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)、左侧颈总动脉进行分离。将ECA起始端、CCA近心端结扎后，通过夹子将翼腭动脉进行短暂夹闭，以此来防止误插，再将线栓插入到CCA中，插入的深度从分叉部位计算为(18±0.5)mm。拉线栓使线头退至颈外动脉为再灌注的处理方法。维持术中的肛肠温度为(37±0.5)℃，再灌注72 h，缺血时间为2 h。在再灌注后2 h及缺血期间保持大鼠体温在(37±0.5)℃。丹参酚酸A高剂量和低剂量组在术后60 min、1 d、2 d，分别将30 mg/kg和10 mg/kg的丹参酚酸A通过腹腔注射的方式给药。模型组和假手术组给予等量的0.9%氯化钠溶液处理。建模成功的标志为大鼠手术麻醉清醒后出现提尾时向一侧转圈、站立不稳、左侧肢体瘫痪。

1.3.2 术后24 h 脑梗死体积测定[11]：每组随机选择5只大鼠，断头处死进行取脑，将低位脑干、小脑、嗅球弃去，将其置于-20 ℃冰箱进行20 min的冷冻处理，在距离额极3 mm的位置进行切片处理，每片的厚度为2 mm，之后将其置于含有1%氯化三苯基四氮唑(TTC)的水溶液中，在37 ℃条件下进行30 min的孵育处理。此时缺血区域逐渐转变成白色，有正常血供的脑组织逐渐转换成红色。染色后采用10%的甲醛溶液进行24 h的避光保存处理，拍照后，梗死面积采用病理图像分析仪进行测定。根据公式V=(A1+A2+A3+A4+A5)t/2对梗死的体积进行计算，其中A为梗死面积，t为切片的厚度。

1.3.3 神经行为学评分标准[12]：采用 Longa评分法对苏醒6 h以后的大鼠随机抽取5只进行神经功能评分，其中昏迷或者不能自己行走的为4分；向右侧倾倒者为3分；向右侧旋转为2分；右侧前肢不能完全伸直为1分；无神经缺损症状为0分。当大鼠出现提前死亡、呼吸困难或处死后有蛛网膜下腔出血者均弃用。

1.3.4 脑组织相关因子水平测定：再灌注72 h后，于各组分别随机抽取5只大鼠，麻醉后，断头处死取脑，将低位脑干、小脑、嗅球弃去，将其置于-20 ℃冰箱进行20 min的冷冻处理，将脑组织进行离心处理，制备成10%的脑匀浆。应用酶联免疫吸附法对GDNF及BDNF水平进行测定；应用硫代巴比妥法对MDA水平进行测定；应用DTNB法对GSH-Px水平进行测定；应用黄嘌呤氧化酶法对SOD水平进行测定。

1.3.5 脑组织石蜡切片的制备：分别在灌注24、48、72 h后给予大鼠再次麻醉，经过PBS(含4%多聚甲醛)灌注固定后，将脑组织取出，以视交叉和其位置向后4 mm位置，按照这两点进行冠状切片处理，之后常规脱水、浸蜡、包埋，再进行连续的冠状石蜡切片，片厚为5 μm。

1.3.6 原位杂交法检测HSP70 mRNA[13]：将上述切片进行常规脱蜡、水化处理，通过原位杂交试剂盒对大鼠脑组织中的HSP70 mRNA进行测定，当胞核或者胞浆为棕色颗粒时，即为阳性染色。以PBS代替核探针，作为阴性对照，其他步骤同上。最后将阳性细胞进行统计，并通过高倍显微镜(×400)对其进行观察，随机选择5个不重叠的视野，进行阳性细胞平均值的计算。

1.3.7 免疫组化法检测HSP70蛋白[14]：DAB、SP试剂盒、一抗HSP70多克隆抗体均由北京百奥莱博科技有限公司提供。上述切片进行常规脱蜡、水化处理，将第一抗体加入其中，之后通过常规SP法进行切片的染色处理，显色通过DAB进行，蒸馏水冲洗、脱水、透明、封片处理，当胞核或者胞浆为棕色颗粒时，即为阳性染色。一抗采用山羊血清或者PBS代替，作为阴性对照，其他步骤同上。最后将阳性细胞进行统计，通过高倍显微镜(×400)对其进行观察，随机选择5个不重叠的视野，通过Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测定各个视野下的光密度值，取平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件分析数据。计量资料以均数±标准差表示，用t检验；P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠造模24 h后脑梗死体积比较 见表1。低剂量组、高剂量组大鼠脑梗死体积均低于模型组，且高剂量组脑梗死体积明显更低(P<0.05)。

表1 各组大鼠造模24 h后脑梗死体积比较(mm3)

2.2 各组大鼠造模72 h后脑组织细胞因子水平比较 见表2。模型组、低剂量组、高剂量组大鼠脑组织BDNF、GDNF水平均明显高于假手术组，且模型组、低剂量组、高剂量组脑组织BDNF、GDNF水平呈现逐渐升高的趋势，经比较差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组、低剂量组、高剂量组大鼠脑组织SOD、GSH-Px水平低于假手术组，MDA水平高于假手术组，且模型组、低剂量组、高剂量组脑组织SOD、GSH-Px水平呈现逐渐升高趋势，MDA水平呈现逐渐降低趋势，经比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠造模72 h后脑组织细胞因子水平比较

2.3 各组大鼠不同时间点神经行为学评分比较 见表3。实验24、48、72 h后，低剂量组、高剂量组大鼠神经行为学评分均低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，且高剂量组大鼠神经行为学评分明显低于低剂量组(P<0.05)。

表3 各组大鼠不同时间点神经行为学评分比较(分)

2.4 各组大鼠不同时间点缺血皮层内HSP70 mRNA表达比较 见表4(图1)。实验24、48、72 h后， 模型组、低剂量组、高剂量组大鼠缺血皮层内HSP70 mRNA阳性细胞计数均明显高于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.05);且模型组、低剂量组、高剂量组三组大鼠缺血皮层内HSP70 mRNA阳性细胞计数呈现逐渐升高的趋势，经比较差异具有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组大鼠不同时间点缺血皮层内HSP70 mRNA阳性细胞计数比较(个)

A：模型组；B：低剂量组；C：高剂量组；D：假手术组

2.5 各组大鼠不同时间点缺血皮层内HSP70蛋白表达比较 见表5(图2)。实验24、48、72 h后， 模型组、低剂量组、高剂量组大鼠脑组织缺血皮层内HSP70蛋白表达OD值均明显高于假手术组，经比较差异具有统计学意义(P<0.05)；且模型组、低剂量组、高剂量组大鼠缺血皮层内HSP70蛋白表达OD值呈现逐渐升高的趋势，组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表5 各组大鼠不同时间点缺血皮层内HSP70蛋白表达OD值比较

A：模型组；B：低剂量组；C：高剂量组；D：假手术组

3 讨 论

根据缺血性脑梗死再灌注损伤患者的临床症状，本病应归为中医学“中风病”的诊疗范畴，中医学对本病最早的阐述可追溯至《黄帝内经》，而《诸病源候论》则将本病的病因病机总结为“中风者，风气中于人也”，认为本病的发生与外邪侵袭相关，而随着对本病认识的深入，后世医家提出了“五志过极、蒙蔽心神”“痰湿内生，痰瘀阻络”“元气亏虚、脑窍失养”等多种学说，并进行辨证应用中医药疗法进行治疗，均取得了良好的治疗效果[15]。自由基学说是脑缺血再灌注损伤的机制之一，其认为在脑部缺血以后，大脑通过一氧化氮合成酶途径、超氧化酶和白细胞及血小板表面NADPH氧化酶途径、花生四烯酸途径、黄嘌呤氧化酶途径合成大量自由基，从而损伤脑细胞，造成再灌注损伤[16]。

研究显示[17]，人体内细胞可以通过非酶系统以及酶系统实现自我抗氧化的效果。GSH-Px和SOD是人体抗氧化酶系统中的重要物质，其中GSH-Px是特异性过氧化氢分解催化酶，可促进还原型谷胱甘肽转化为氧化型谷胱甘肽，致使自由基向无毒的羟基转化，从而达到抑制氧化物损伤的效果，保护细胞。SOD是抗氧化系统的重要组成部分，可清除体内的超氧阴离子自由基，促使其发生歧化作用，进而对自由基损伤产生抑制效果，为监测自由基清除能力的重要指标[18]。MDA则为脂质过氧化反应产物，其不仅可与脂质发生交联反应，同时也可促使脂质向高分子聚合物转化，并在细胞内沉积和溶酶消解，当上述高分子聚合物浓度较高时，就会对细胞的DNA结构产生损伤，诱导细胞发生凋亡[19]。本研究各组脑组织SOD、GSH-Px及MDA水平结果提示，经丹参酚酸A干预后，不仅大鼠体内的氧自由基可得到有效地清除，同时缺血再灌注性细胞损伤也可得到明显控制。有研究显示[20]，给予大鼠1个月的丹参酚酸盐喂养以后，其肾脏组织的SOD活性显著升高，自由基含量降低，肾功能得到显著改善。Wang等[21]研究显示，丹参酚酸盐可以对羟自由基进行有效清除。Sun 等[22]研究显示，丹参酚酸盐可以对黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤系统产生的铁离子依赖羟自由基和氧自由基进行有效清除。机体内自由基被有效清除后，GSH-Px和SOD的消耗量大大降低，其活性相应增加，脑组织抗自由基损伤能力增加。

本研究所用的丹参酸酚A提取自中药丹参，丹参具有“活血通络，通经止痛”的功效，常与桃仁、红花、三七、川芎等药配伍，可用于冠心病、脑梗死、关节肿痛、月经不调等疾病的治疗，具有良好的应用效果[23]。丹参多酚酸为丹参主要有效成分，属水溶性的有机酸类化合物，具有降低脑梗死水肿面积的作用，可有效对脑组织神经功能进行保护[24]。本研究结果显示，高剂量组大鼠脑组织BDNF、GDNF水平明显较高。这是由于BDNF、GDNF是重要的神经营养因子，在神经元的生长和分化中具有重要的作用。而神经元抗缺血损伤的能力与脑组织中的BDNF、GDNF变化关系较为密切，而给予大鼠外源性的BDNF、GDNF同样可以发挥保护缺血性脑组织的功效。动物实验研究结果显示[25]，BDNF、GDNF具有减少脑缺血后梗死面积的功效，有助于修复大鼠受损的神经元。上述结果也证实了高水平表达的BDNF、GDNF可以减少神经元的凋亡，减轻缺血性脑组织损伤，也是自身的一种保护机制。这种机制可能与下述因素关系密切：①钙超载的降低，促进神经元突触的生长和发芽；②对兴奋性氨基酸毒性作用的拮抗效果；③对自由基的清除作用，进而引发神经细胞凋亡的抑制。正常情况下，脑组织内的HSP含量相对较低。当出现脑部缺血时，HSP-70会在变性蛋白的诱导下增加合成量，进而增强脑细胞对缺氧、缺血的耐受性。有研究显示[26]，HSP-70不仅可在大脑缺血早期保护脑组织细胞免受损伤，在缺血后期对细胞修复的作用也较为显著。本文免疫组化和原位杂交结果显示，高剂量的丹参酚酸A可以促进HSP-70蛋白的表达。这可能与丹参酚酸A消除自由基的特性有关，可以较好地减少神经细胞损伤，减轻能量消耗，促进HSP-70蛋白基因的表达。

综上所述，丹参酚酸A可以有效地对脑缺血再灌注损伤大鼠的自由基进行清除，减少梗死面积，增加HSP70蛋白基因的表达，具有缺血脑保护作用。